應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析成品甜芽菜微生物多樣性

白光劍，鄒偉，李豪，張靜

(四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000)

芽菜是一種風(fēng)味獨(dú)特的傳統(tǒng)醬腌菜，在我國川南地區(qū)較為盛行[1]。其生產(chǎn)流程包括：第一步，將新鮮的芥菜切成細(xì)條狀并曬干；第二步，將曬干的芥菜條清洗、加鹽混勻并放入容器中發(fā)酵1周左右，然后將鹽去掉，繼續(xù)曬干芥菜條；第三步，將芥菜放入桶內(nèi)，同時(shí)添加胡椒、茴香、姜、蔥等調(diào)料，室溫密封發(fā)酵6～12個(gè)月即成。芽菜可分為甜芽菜和咸芽菜兩種。第三步發(fā)酵前加入紅糖后得到的芽菜屬于甜芽菜，不加紅糖發(fā)酵得到的是咸芽菜。目前宜賓芽菜主要通過自然發(fā)酵生產(chǎn)，這一過程中大量環(huán)境微生物為宜賓芽菜獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)形成起著關(guān)鍵作用。國內(nèi)對芽菜的研究主要集中在芽菜中重要微生物的分離篩選和芽菜風(fēng)味物質(zhì)的檢測[2-6]。本文主要通過高通量測序技術(shù)研究成品芽菜中微生物群落多樣性，確定甜芽菜中重要的微生物，為后續(xù)工作中加強(qiáng)宜賓芽菜微生物資源的開發(fā)提供一定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品取自自貢市某農(nóng)貿(mào)市場，所有分析樣品均為無菌采樣，收集3組樣品后立即用4～6 ℃的便攜式冷藏箱2 h內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，貯存在冰箱待用。

1.2 樣品DNA提取與PCR擴(kuò)增

樣品DNA的提取采用土壤基因組DNA快速提取試劑盒升級版50次(離心柱型)，購于BioTeke公司，然后用核酸蛋白儀檢測DNA 的濃度和純度。真菌18S V5-V7區(qū)域擴(kuò)增通用引物：SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)、1196R(5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′)。真菌 PCR(50 μL)擴(kuò)增體系：dNTP Mixture 4 μL，10×PCR Buffer(Mg2+plus)5 μL，正向和反向引物各1 μL，模板 DNA 5 μL，Ex Taq 酶 0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL，混合均勻。真菌 PCR擴(kuò)增程序：98 ℃ 3 min；98 ℃ 45 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，反應(yīng)共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 8 min。細(xì)菌 16S rRNA V4 擴(kuò)增通用引物：16S 338F(5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3′)、16S 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。細(xì)菌 PCR(50 μL)擴(kuò)增體系：dNTP Mixture 4 μL，10×PCR Buffer(Mg2+plus) 5 μL，正向和反向引物各 1 μL，模板 DNA 5 μL，Ex Taq 酶 0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL，充分混勻。細(xì)菌PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，反應(yīng)共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。根據(jù) PCR 擴(kuò)增圖譜，擴(kuò)增后的條帶比較清晰明顯且條帶位置一致，背景干凈，DNA 濃度達(dá)到了擴(kuò)增要求，可直接用于后續(xù)分析。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)優(yōu)化處理

保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，運(yùn)用Qiime進(jìn)行序列過濾[7]，數(shù)據(jù)過濾標(biāo)準(zhǔn)為：去除5′端引物錯(cuò)配堿基數(shù)>1的序列；去除含有N(模糊堿基)的序列；去除含有連續(xù)相同堿基數(shù)>8的序列；去除長度≤150 bp的序列；去除嵌合體序列。運(yùn)用 Mothur軟件中的Uchime方法去除嵌合體序列，得到最終用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列[8]。

1.4 OTU聚類分析及注釋

聚類分析主要通過在Qiime中調(diào)用Uclust的方法完成，OUT注釋主要通過在Qiime中調(diào)用Blast的方法對序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，OUT精簡的方法參考文獻(xiàn)[9]。

1.5 多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析

種群豐富度指數(shù)Chao指數(shù)和ACE指數(shù)，群落多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，主要通過軟件Mothur中的summary.single命令計(jì)算獲得。不同分類水平上(門、屬)的物種豐度表和豐度圖主要通過Qiime軟件完成。

1.6 稀釋曲線制備

稀釋性曲線(rarefaction curve)采用對測序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建。使用97%相似度的OTU利用mothur做rarefaction分析，利用R語言工具制作稀釋性曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列長度分布

測序結(jié)果顯示：本研究3個(gè)芽菜樣品所測得的細(xì)菌Reads共71140條，分布在401～460 bp長度范圍內(nèi)，平均長度為447.5 bp，長度在441～460 bp范圍內(nèi)占89.38%，有63854條；3個(gè)樣品所測得的真菌Reads共60900條，分布在261～420 bp長度范圍內(nèi)，平均長度為402.26 bp，長度在401～420 bp范圍內(nèi)占93.18%，有56746條。從序列長度的分布來看，與細(xì)菌16S rDNA-V4區(qū)序列大致吻合。

2.2 實(shí)驗(yàn)樣品中微生物群落多樣性結(jié)果

利用高通量測序技術(shù)，經(jīng)序列過濾和去除嵌合體序列，3個(gè)芽菜樣品最終得到用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析的細(xì)菌有效序列65797條，有效率為92.49%；真菌的有效序列54750，有效率為89.90%。本次研究3個(gè)樣品共產(chǎn)生細(xì)菌OTU數(shù)609個(gè)，每個(gè)樣品203個(gè)，細(xì)菌群落分布在7個(gè)門、15個(gè)綱、31個(gè)目、63個(gè)科、114個(gè)屬，見表1。3個(gè)樣品共產(chǎn)生真菌OTU數(shù)109個(gè)，樣品1和樣品3各36個(gè)，樣品2 OTU數(shù)37個(gè)，其群落分布在7個(gè)門、16個(gè)綱、24個(gè)目、30個(gè)科、28個(gè)屬中，見表2。

表1 細(xì)菌16S rDNA序列豐富度及多樣性Table 1 Richness and diversity of bacterial 16S rDNA sequence

表2 真菌18S rDNA序列豐富度及多樣性Table 2 Richness and diversity of fungal 18S rDNA sequence

2.3 多樣性指數(shù)分析

群落生態(tài)學(xué)中研究微生物多樣性，通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，包括一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。有用于計(jì)算菌群豐度(community richness)的指數(shù)Chao、ACE，用于計(jì)算菌群多樣性(community diversity)的指數(shù)Simpson、Shannon，以及代表測序深度的指數(shù)Coverage。其中Chao或ACE指數(shù)越大，說明群落豐富度越高；Shannon值越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低；Coverage值越高，則樣本中序列被測出的概率越高。

由表1和表2可知，細(xì)菌的Chao和ACE指數(shù)均大于真菌，說明成品甜芽菜中細(xì)菌群落豐富度大于真菌群落；從Simpson和Shannon指數(shù)來看，細(xì)菌群落的多樣性也高于真菌；兩者Coverage指數(shù)都非常接近1，表明本次測序結(jié)果能代表樣本中微生物的真實(shí)情況。

2.4 微生物多樣性稀釋性曲線

綜合數(shù)據(jù)和稀釋曲線分析來看(見圖1)，在較少的測序數(shù)范圍內(nèi)，真菌和細(xì)菌均有大量的OTU產(chǎn)生，細(xì)菌較真菌有更多的OTU。各樣本所代表的曲線斜率，在測序數(shù)5000左右驟然下降，真菌的稀釋曲線有少量新的OTU產(chǎn)生，細(xì)菌OTU變化很小，隨著測序深度增加，真菌和細(xì)菌的稀釋曲線斜率趨于平穩(wěn)。說明測序數(shù)據(jù)量合理，能有效地反映芽菜中微生物的豐富度和多樣性。

圖1 芽菜樣品中微生物變化稀釋曲線 Fig.1 Microbial variation dilution curves of samples

注：A為細(xì)菌變化稀釋曲線圖;B為真菌變化稀釋曲線。

2.5 微生物豐度分析

由于通常測序分析，芽菜樣品能檢測出大量微生物種類，但許多物種含量稀少，不能與含量多的物種明顯體現(xiàn)在同一個(gè)圖中，所以將物種的豐度大于1%作為劃分依據(jù)，以相對豐度為縱坐標(biāo)，繪制柱形圖。從細(xì)菌門的分類水平來看，3個(gè)樣品所得結(jié)果基本相同，共檢測出7個(gè)細(xì)菌門，分別是放線菌門 (Actinobacteria)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、變形菌門 (Proteobacteria)、無壁菌門(Tenericutes)。其中優(yōu)勢細(xì)菌有變形菌門(49.1%)、厚壁菌門(40.9%)、放線菌門(5.1%)、擬桿菌門(2.6%)、藍(lán)細(xì)菌(2.6%)(所得豐度值百分比取3個(gè)樣品的平均值，下同)，其他細(xì)菌菌門豐度值均小于1%，(見圖2A)。從細(xì)菌屬的分類水平來看，共檢測出114個(gè)屬，按其豐度值排序，分別是鹽單胞菌屬(Halomonas，27.2%)、芽孢桿菌屬(Bacillus，11.9%)、腸球菌屬(Enterococcus，6.8%)、Lactococcus，96.2%)、假單胞菌屬(Pseudomonas，5%)、Enterobacteriaceae_unclassified(4.8%)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium，4.5%)、歐文氏菌屬(Erwinia，2.6%)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium_1，2.5%)、魏斯氏菌屬(Weissella，2.2%)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus，2.2%)、Cyanobacteria_norank(2.1%)、拉恩菌屬(Rahnella，1.4%)、葡萄球菌屬(Staphylococcus，1.4%)、Alkaliphilus(1.4%)、Acinetobacter(1.0%)，其他菌群豐度小于1%，占總菌群豐度的15.2%(見圖2B)。

圖2 成品甜芽菜細(xì)菌群落門(A)和屬(B)水平相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacteria in the finished product of sweet sprouts at phylum(A)and genus(B)levels

從真菌門的分類水平來看，3個(gè)樣品共檢測出6個(gè)門的真菌：Arthropoda、子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、Ciliophora、Phragmoplastophyta、結(jié)合菌門(Zygomycota)，其中占優(yōu)勢的門是Ascomycota(63.7%)，Basidiomycota(36.1%)，其他 4個(gè)菌門豐度所占百分比之和約占0.2%(見圖3A)。從真菌屬的分類水平來看，共檢測到28個(gè)屬，按其豐度排序分別是Saccharomycetales_unclassified(28.5%)，樣品2的略高于其他兩個(gè)樣品，德巴利酵母屬(Debaryomyces，15.8%)，F(xiàn)ilobasidiaceae_norank(14.1%)，Cladosporium(7.1%)，Itersonilia(6.6%)，Incertae_Sedis_Incertae_sedis(6.1%)，Leucosporidiales_norank(5.3%)，Pleosporaceae_unclassified(5.2%)，核盤菌屬(Sclerotinia，5.0%)，Tremellales_norank(3.2%)，其他菌群豐度均小于1%，占總菌群豐度的3.1%(見圖3B)。

圖3 成品甜芽菜真菌群落門(A)和屬(B)水平相對豐度Fig.3 Relative abundance of fungi in the finished product of sweet sprouts at phylum(A)and genus(B)levels

3 討論

本文采用Miseq高通量測序技術(shù)對成品甜芽菜中細(xì)菌和真菌多樣性進(jìn)行研究。對細(xì)菌的測序顯示，共得到65797條有效序列，聚類分析共產(chǎn)生609個(gè)OTU，3個(gè)樣品較為平均，各有203個(gè)，分屬7個(gè)門114個(gè)屬內(nèi)，其中從門水平來看Proteobacteria(49.1%)，F(xiàn)irmicute(40.9%)具有較大優(yōu)勢；從屬水平來看，鹽單胞菌屬(Halomonas，27.2%)的豐度最高，芽孢桿菌屬(Bacillus，11.9%)次之。與前期報(bào)道芽菜發(fā)酵過程細(xì)菌多樣性相比[10]，Bacillus和Pseudomonas均為優(yōu)勢菌株，但成品芽菜中的Halomonas，Enterococcus，Lactococcus在發(fā)酵過程中優(yōu)勢不明顯。發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株如Flavobacteriaceae，Sphingobacterium，Sphingomonas，Acidovorax，Chromohalobacter，Arthrobacter在成品甜芽菜中優(yōu)勢并不明顯。真菌的測序共得到有效序列54750條，聚類分析共產(chǎn)生109個(gè)OTU，分屬7個(gè)門28個(gè)屬。從門水平來看，Ascomycota(63.7%)，Basidiomycota(36.1%)具有絕對優(yōu)勢，其他真菌門豐度較小。從屬水平結(jié)果看Saccharomycetales_unclassified(28.5%)，Debaryomyces(15.8%)，F(xiàn)ilobasidiaceae_norank(14.1%)3個(gè)菌屬較為優(yōu)勢。與芽菜發(fā)酵過程相比[11]，發(fā)酵150天時(shí)Debaryomyces(62%)相比優(yōu)勢下降。可以看出即便是與發(fā)酵末期相比，芽菜中的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)和豐度都發(fā)生了不小的變化。

目前，已有學(xué)者對芽菜發(fā)酵過程以及成品芽菜的風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究[12]。成品甜芽菜的主要風(fēng)味成分為丁酸、E-11-棕櫚酸乙酯、2,3-丁二醇、2,6,10-三甲基十四烷、芥子酸、1-十八烷烯、1H-吲哚-3-乙腈。解析芽菜中微生物群落組成與其風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生之間的關(guān)系不僅有助于理解芽菜的風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)制，同時(shí)也有助于進(jìn)一步控制芽菜質(zhì)量，但相關(guān)研究較少，將是未來研究的熱點(diǎn)。