右旋糖酐的理化性質(zhì)研究

王帥靜，藍(lán)尉冰，陳玉穎，黃雙霞，齊鵬翔，陳山*

(1.廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，南寧 530004；2.廣西大學(xué) 糖業(yè)工程技術(shù)研究中心， 南寧 530004；3.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530004)

右旋糖酐是一種完全由α-D-吡喃葡萄糖單體聚合成的同型胞外多糖，其用途與聚合的葡萄糖分子數(shù)目密切相關(guān)，分子量不同，其應(yīng)用領(lǐng)域也有所不同[1]。微小分子量(Mw<105Da)的右旋糖酐主要用于醫(yī)學(xué)上，是目前最佳的血漿代用品之一，能阻止紅細(xì)胞及血小板聚集，降低血液粘滯性[2]。中分子量(105Da106Da)的右旋糖酐可作為色譜柱的填充劑等[4]。

目前對右旋糖酐的研究多集中在制備機(jī)理以及聚合過程動力學(xué)，但是關(guān)于右旋糖酐的生理活性及在食品、化妝品中的應(yīng)用研究卻鮮有報道。本課題組前期通過研究不同中分子量的右旋糖酐(Mw：1951100，1047200，512000，253900，107500 Da)分別在吸濕保濕性、抗氧化性和抗過敏抗刺激性等方面的性質(zhì)，得出低分子量右旋糖酐(Mw:107500 Da)抗氧化性優(yōu)于其他高分子量右旋糖酐，但吸濕保濕性卻略遜色些，且均有良好的安全性。本文將低分子量右旋糖酐(Mw：107500 Da)與其他高分子量右旋糖酐進(jìn)行復(fù)配，測定其吸濕保濕性、抗氧化性、乳化性和乳化穩(wěn)定性，探究其不同分子量之間的功效協(xié)同作用，為篩選合適的右旋糖酐分子量體系作為乳化增稠劑應(yīng)用于食品、化妝品領(lǐng)域提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

腸膜明串珠菌CICC-21724：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；果糖、蔗糖、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、醋酸鈉、冰醋酸、硫酸、氯化鈣、3,5-二硝基水楊酸：AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙二醇6000、磷酸氫二鉀、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、十二烷基硫酸鈉：AR，廣東光華科技股份有限公司；牛肉膏、酵母膏：BR，北京奧博星生物科技有限公司；瓊脂：BR，廣東環(huán)凱生物科技有限公司；蛋白胨：BR，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；魯花花生油：購于南寧百貨超市。

UV-1200紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Aglient 1100 HPGFC色譜儀(配有示差折光檢測器Aglient G1362A及Aglient GPC數(shù)據(jù)分析軟件)；LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；ZHJH-1115C垂直流超凈工作臺，ZHWY-211B全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Avanti J-E多用途高效離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；XH-C旋渦振蕩儀 金壇市醫(yī)療儀器廠；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖酐蔗糖酶的制備及分離純化

目前，由于右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase，縮寫為DS，合成酶)無商品酶，本實(shí)驗(yàn)所用的右旋糖酐蔗糖酶均為自制?；谡n題組的前期研究，右旋糖酐蔗糖酶粗酶液制備及雙水相萃取純化方法如下[5]：

1.2.2 右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶酶活力的測定

右旋糖酐蔗糖酶能夠與單底物蔗糖發(fā)生反應(yīng)，使D-吡喃葡萄糖基轉(zhuǎn)移到右旋糖酐鏈上，生成的果糖單元與葡萄糖單元的量一樣，因此，右旋糖酐的產(chǎn)量可通過換算果糖的生成量來測定。定義在25 ℃條件下，右旋糖酐蔗糖酶1 min內(nèi)催化底物蔗糖生成1 μmol果糖所需要的酶量為1個酶活單位(U)[6]。一般情況下，果糖的生成量采用3,5-二硝基水楊酸法(即DNS法)來測定，根據(jù)吸光值與還原糖含量的線性關(guān)系計算酶活。

實(shí)驗(yàn)所用右旋糖酐酶(Dextranase，縮寫為DN，分解酶)為商品酶。右旋糖酐酶僅對α-1,6糖苷鍵專一性水解，使大分子右旋糖酐分解成小分子的還原糖。采用Hens法測定酶解產(chǎn)生的還原糖，進(jìn)而間接計算右旋糖酐酶的活力，右旋糖酐酶的酶活力定義為在25 ℃條件下，1 min內(nèi)催化底物Dextran-70產(chǎn)生與1 μmol硫代硫酸鈉的還原力相當(dāng)?shù)倪€原糖所需要的右旋糖酐酶的酶量。

1.2.3 不同分子量右旋糖酐樣品的制備

基于課題組前期的研究[7]，以蔗糖為反應(yīng)底物，選取單酶法和游離雙酶法2種方法構(gòu)建5個終體積均為100 mL的反應(yīng)體系，見表1。通過乙醇分級沉降制備不同分子量的右旋糖酐。

天祝牧區(qū)高寒草原生態(tài)安全2007～2014年呈現(xiàn)“安全”的狀態(tài)，總體發(fā)展良好，但部分指標(biāo)回落，超載率和草原退化率是制約該牧區(qū)高寒草原生態(tài)安全的主要因子。利用物元模型評價得出的天祝牧區(qū)高寒草原生態(tài)安全結(jié)果與實(shí)際客觀情況較為吻合，說明該評價方法在高寒草原生態(tài)安全的評級中具有一定的應(yīng)用價值。但是物元模型在高寒草原生態(tài)安全評價的研究較少，所以模型中量值范圍的確定及模型的普適性仍需深入分析和研究。

表1 酶法制備右旋糖酐的發(fā)酵體系Table 1 The fermentation system for preparation of dextran by enzymatic method

將以上體系置于25 ℃，120 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)30 h后，立即放入沸水浴中滅活。對體系1單酶法制得的發(fā)酵液經(jīng)30%乙醇在45 ℃醇沉22 h離心得右旋糖酐大分子量樣品。對體系2～5游離雙酶法制得的發(fā)酵液采用分級醇沉的方法，先用40%的乙醇在40 ℃下沉降22 h離心得右旋糖酐中分子量樣品，再用50%乙醇在34 ℃下沉降12 h離心得右旋糖酐小分子量樣品。把通過乙醇醇沉制得的樣品經(jīng)真空冷凍干燥，去除產(chǎn)品中的乙醇和水分，打磨成粉置于干燥器中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 HPGFC色譜條件及右旋糖酐分子量的測定

采用高效凝膠色譜法測定醇沉樣品的分子量，HPGFC色譜檢測條件為：安捷倫1100系統(tǒng)配RID示差檢測器，色譜柱Shodex Sugar KS-801、KS-805和KS-guard(保護(hù)柱)，流動相為超純水，流速為1.0 mL/min，檢測器溫度為33 ℃，柱溫箱溫度為65 ℃。

將樣品用0.45 μm微孔膜過濾，每次進(jìn)樣量為20 μL，平行操作3次。

1.2.5 吸濕性的測定

將樣品于50 ℃烘箱內(nèi)干燥48 h至質(zhì)量恒定，準(zhǔn)確稱取1.000 g至相對濕度恒定的恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行吸濕性實(shí)驗(yàn)，以透明質(zhì)酸和海藻糖為對照。溫度為30 ℃，濕度為81%。吸濕率計算公式為[8]：

式中：m0為樣品的初始質(zhì)量，g；mn為放置n h后的樣品的質(zhì)量，g。

1.2.6 保濕性的測定

準(zhǔn)確稱取質(zhì)量恒定的樣品0.5000 g于稱量瓶中，加入樣品質(zhì)量40%的蒸餾水，緩慢晃動稱量瓶，待樣品充分吸水后放入底部放有充分干燥硅膠的干燥器中，并置于30 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行保濕性實(shí)驗(yàn)，以透明質(zhì)酸和海藻糖為對照。保濕率計算公式為[9]：

式中：m0為樣品的初始含水質(zhì)量，g；mn為放置n h后樣品的含水質(zhì)量，g。

1.2.7 抗氧化性的測定(鐵離子還原力法)

在潔凈的試管中分別加入不同濃度的多糖樣品2 mL，pH 6.6的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液2 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2 mL，旋渦振蕩儀振蕩混勻后于50 ℃水浴20 min后迅速冷卻，加入10%的三氯乙酸2 mL，混勻后離心(3000 r/min,10 min)，取2 mL上清液、2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%的FeCl3溶液混勻，靜置10 min，空白對照以蒸餾水代替多糖，于700 nm處測吸光度值，吸光值越大，還原力越強(qiáng)。以Vc為對照。

還原力=樣品吸光值-空白對照組吸光度。

1.2.8 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

將1 mL花生油和3 mL一定質(zhì)量濃度的樣品溶液混合，用旋渦振蕩儀充分混勻1 min，用移液槍快速從杯底取100 μL溶液并加入到10 mL 0.1%的SDS溶液中，震蕩混勻，立即在500 nm波長下比色(0.1% SDS為空白)，測定0 min時的吸光值A(chǔ)0，靜置10 min后取樣，同樣方法測A10，A0表示乳化活性(EA)，乳化穩(wěn)定性(ESI)表示為[10]：

ESI=(A0×△T)/(A0-A10)。

式中：ESI的單位為min；A0為0 min的吸光值；△T為測定兩次乳化的時間間隔，本實(shí)驗(yàn)為10 min；A10為10 min的吸光值。光對較大顆粒敏感，因此吸光度越小，乳化活性越好。

2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及右旋糖酐分子量的檢測的結(jié)果與分析

2.1 各標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

基于課題組的前期研究方法，對右旋糖酐蔗糖酶酶活測定中果糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行繪制，并進(jìn)行線性擬合，得到擬合方程為Y=0.82905X-0.03017，R2=0.9988，式中：X為果糖質(zhì)量(mg)，Y為樣品在545 nm波長下的吸光度值。

右旋糖酐分子量校正曲線的建立：將重均分子量為667，5900，11800，22800，47300，112000，212000，404000，788000，2000000 Da的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品配制成10 mg/mL的溶液，在HPGFC色譜工作站條件下進(jìn)行檢測，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，右旋糖酐分子量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制得右旋糖酐分子量校正曲線為Y=13.6199-1.54808X+0.11534X2-0.00379X3，R2=0.9998，式中：Y為右旋糖酐分子量的對數(shù)值，X為洗脫體積，R2值為0.9998。

2.2 右旋糖酐樣品分子量的檢測

通過乙醇分級沉降提取不同分子量的右旋糖酐，經(jīng)高效液相色譜檢測，右旋糖酐的分子量分布見表2。

表2 右旋糖酐樣品的分子量及分布Table 2 Molecular weight and its distribution of dextran samples

實(shí)驗(yàn)所用右旋糖酐樣品的重均分子量分別為1047200，512000，272680，205900，109300 Da，分別表示為Dex-1000、Dex-500、Dex-270、Dex-200、Dex-100。

本實(shí)驗(yàn)所用4個復(fù)配體系分別為Dex-100與Dex-200、Dex-270、Dex-500、Dex-1000，記為體系1～4。

2.3 右旋糖酐的吸濕和保濕能力

用體外稱重法測定右旋糖酐的吸濕性和保濕性，以樣品的放置時間為橫坐標(biāo)，以吸濕率或保濕率為縱坐標(biāo)作圖，吸濕性結(jié)果見圖1，保濕性結(jié)果見圖2。

圖1 Dex-100單一及復(fù)配體系和對照組的吸濕率Fig.1 The hygroscopicity of the single and complex systems with Dex-100 and control group

圖2 Dex-100單一及復(fù)配體系和對照組的保濕率Fig.2 The moisture retention of the single Dex-100 and complex systems and control group

由圖1可知，在30 ℃、相對濕度為81%的條件下，4種復(fù)配體系的吸濕性均優(yōu)于Dex-100單一體系，且體系4表現(xiàn)出優(yōu)異的吸濕性，與傳統(tǒng)保濕因子透明質(zhì)酸的吸濕能力相當(dāng)，Dex-100以及4種復(fù)配體系的吸濕能力均優(yōu)于“生命之糖”海藻糖。由圖2可知，在30 ℃、強(qiáng)干燥環(huán)境下，Dex-100單一體系和4種復(fù)配體系的保濕能力相當(dāng)，雖均遜色于透明質(zhì)酸和海藻糖，但相差并不太大，且在24 h后仍具有5%左右的保濕能力。

右旋糖酐具有良好的吸濕保濕性可能與其本身結(jié)構(gòu)中含有大量羥基和醛基有關(guān)，這些極性基團(tuán)可與水分子形成結(jié)合力較強(qiáng)的氫鍵，氫鍵之間呈交織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)牢牢鎖住水分。Dex-100右旋糖酐通過與高分子量右旋糖酐復(fù)配，可以提高其吸濕能力，原因在于高分子量右旋糖酐含有極性基團(tuán)數(shù)目更多，因而表現(xiàn)出更強(qiáng)的氫鍵結(jié)合力。

2.4 右旋糖酐的抗氧化性

Fe3+在反應(yīng)體系環(huán)境下，獲得被測物質(zhì)提供的電子而被還原為Fe2+，使得反應(yīng)體系顏色加深，吸光度增大。吸光度越大，說明被測物質(zhì)的還原力越強(qiáng)，即抗氧化能力越好。以各反應(yīng)體系的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作圖，樣品和對照樣的抗氧化能力見圖3和圖4。

圖3 Dex-100單一及復(fù)配體系對Fe3+的還原力Fig.3 The ferric reducing power of the single Dex-100 and complex systems

圖4 對照樣Vc對Fe3+的還原力Fig.4 The ferric reducing power of Vc for the control sample

由圖3和圖4可知，Dex-100和各復(fù)配體系以及對照樣Vc的抗氧化能力均隨濃度的升高而增大，Dex-100和Vc的抗氧化能力與濃度之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。Dex-100和各復(fù)配體系均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，復(fù)配體系的抗氧化能力優(yōu)于單一體系Dex-100，尤其是體系4表現(xiàn)更為明顯，但與Vc相比，抗氧化能力仍相對較弱，當(dāng)體系4中樣品質(zhì)量濃度達(dá)到15 mg/mL時的吸光度為0.063，Vc在質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時的吸光度已達(dá)0.202。以上分析說明，右旋糖酐雖具有一定的抗氧化能力，與Vc相比并不理想，通過不同分子量右旋糖酐之間進(jìn)行復(fù)配，可以適當(dāng)提高其抗氧化性。

2.5 右旋糖酐的乳化性和乳化穩(wěn)定性

右旋糖酐是乳酸菌屬腸膜明串珠菌發(fā)酵而得的細(xì)菌胞外多糖，與植物多糖相比，具有高粘度、濃稠特性以及剪切稀釋性等，可以在水相和油相之間形成穩(wěn)定的乳化液。不同質(zhì)量濃度的Dex-100的乳化性和乳化穩(wěn)定性見圖5，不同分子量右旋糖酐的乳化性和乳化穩(wěn)定性見圖6，Dex-100及各復(fù)配體系的乳化性和乳化穩(wěn)定性見圖7。

圖5 不同質(zhì)量濃度Dex-100的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.5 The emulsification and emulsion stability of Dex-100 with different mass concentration

圖6 不同分子量右旋糖酐的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.6 The emulsification and emulsion stability of dextran with different molecular weights

圖7 Dex-100單一及復(fù)配體系的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.7 The emulsification and emulsion stability of the single Dex-100 and complex systems

由圖5可知，右旋糖酐對油水溶液的乳化性和乳化穩(wěn)定性具有濃度依賴性，Dex-100的乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨著濃度的增加而呈現(xiàn)出增長的趨勢，原因在于右旋糖酐作為胞外多糖，其組分的親水性能夠伸展到水相中，形成水化層，通過空間位阻以及靜電作用保持穩(wěn)定性，在濃度低時，多糖分子不足以包裹油滴形成乳濁液，隨著濃度增大，體系粘稠度增加，使得乳化液更細(xì)膩也更加穩(wěn)定。由圖6和圖7可知，高分子量右旋糖酐的乳化性和乳化穩(wěn)定性要優(yōu)于低分子量右旋糖酐，Dex-100單一及復(fù)配體系的乳化性沒有很大區(qū)別，體系3和體系4的乳化穩(wěn)定性較好，原因可能為高分子量右旋糖酐極性基團(tuán)更多而能夠形成更強(qiáng)的靜電排斥力和空間位阻作用，也可能因?yàn)楦叻肿恿坑倚囚恼扯容^大，使得體系變粘稠，從而使乳化體系穩(wěn)定性上升。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在中分子量范圍內(nèi)，將十萬分子量級別的右旋糖酐與相對較高分子量的右旋糖酐進(jìn)行復(fù)配，各功效間協(xié)同作用能得出較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，和百萬分子量級別的右旋糖酐進(jìn)行復(fù)配效果最佳，其吸濕保濕性和乳化活性較好，且具有一定的抗氧化能力。低分子量右旋糖酐(Mw：109300 Da)雖然具有良好的抗氧化能力，但其吸濕保濕性和乳化活性略遜色于高分子量右旋糖酐，通過將低分子量右旋糖酐與高分子量右旋糖酐進(jìn)行復(fù)配，充分發(fā)揮了低分子量右旋糖酐良好的抗氧化能力和高分子量右旋糖酐良好的吸濕保濕性以及粘度大、乳化活性好的優(yōu)點(diǎn)，為篩選合適的右旋糖酐分子量體系作為乳化增稠劑應(yīng)用于食品、化妝品中提供了參考。