棋盤法和倍比微量稀釋法在體外聯(lián)合 抗真菌活性藥物篩選中的應(yīng)用研究

尹光美，蘇劉艷，李 俊，李加秀，胡金玲，張 祎，王睿睿

(云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

近年來，廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑等藥物的廣泛使用，以及器官移植、導(dǎo)管插管等技術(shù)的普遍應(yīng)用，導(dǎo)致臨床上真菌感染病例不斷增多.其中以白色念珠菌為主的致病性真菌感染較為常見，在條件致病真菌感染中位居第2[1-3]，隨著臨床上抗真菌藥物氟康唑長期大量使用導(dǎo)致白色念珠菌耐藥性普遍產(chǎn)生，臨床治療越發(fā)困難[4-6].目前，耐藥性是臨床治療真菌感染失敗的主要原因[7-8].由于新藥研發(fā)的投入高、周期長、進(jìn)展緩慢[9-10]，聯(lián)合用藥可以發(fā)揮藥物的協(xié)同抗真菌作用，提高療效，并減少真菌耐藥性的產(chǎn)生[11]， 因此尋找與現(xiàn)有抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用效果較好的藥物也是行之有效的方法之一[12].

體外抗真菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)是指導(dǎo)制定合理的臨床診療方案重要的參考依據(jù)[13].對(duì)于大批量聯(lián)合抗真菌藥物的篩選來說，建立快速通量篩選藥物的方法非常必要.棋盤法是最為常用的聯(lián)合用藥篩選方法，但操作較為復(fù)雜，其MIC值的判定常規(guī)用肉眼觀察，在一定程度上受主觀因素影響較大，缺乏客觀性和準(zhǔn)確性；倍比微量稀釋法常用于單藥抗菌活性篩選，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理具有客觀性，如在單藥基礎(chǔ)上改為兩藥聯(lián)合，操作比棋盤法簡單，但其數(shù)據(jù)信息量較棋盤法少.

根據(jù)權(quán)華等[16]的研究，氟康唑與鹽酸小檗堿聯(lián)合使用具有協(xié)同抗耐藥白色念珠菌的作用，故本文分別采用2種方法檢測氟康唑和鹽酸小檗堿對(duì)耐藥白色念珠菌的抗菌活性，計(jì)算FICI值對(duì)比分析后選出操作更加為簡便、準(zhǔn)確、可行的方法作為實(shí)驗(yàn)室大批量聯(lián)合抗真菌藥物篩選的首選方法.

1 主要實(shí)驗(yàn)藥品及儀器

氟康唑(南昌弘益藥業(yè)有限公司，50 mg，171128)；鹽酸小檗堿(成都錦華藥業(yè)有限責(zé)任公司，0.1 g，180401)；沙氏液體培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，250 g，1069251)；DMSO 溶劑(MP Biomedicals，LLC，100 mL，Q6949)；念珠菌臨床耐藥株 23#(由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院李玉葉教授贈(zèng)送)按常規(guī)方法復(fù)蘇，劃板培養(yǎng)，于4 ℃下保存.

酶標(biāo)儀(M200 PRO 多功能酶標(biāo)儀).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥液配制

氟康唑和鹽酸小檗堿均用DMSO溶解，氟康唑配制成50 mg/mL的藥物儲(chǔ)備液，小檗堿配制成100 mg/mL的藥物儲(chǔ)備液，4 ℃下保存.

2.2 棋盤法

2.2.1 操作步驟

參照CLSI M27-A(酵母菌液體培養(yǎng)基稀釋法抗真菌藥物敏感實(shí)驗(yàn))方案[17]，將藥物儲(chǔ)備液用沙氏液體培養(yǎng)基稀釋為2倍倍比質(zhì)量濃度(藥物終質(zhì)量濃度范圍為氟康唑0.25～128 μg/mL，鹽酸小檗堿1～64 μg/mL).按照如下方法進(jìn)行操作：由高濃度到低濃度的順序，取50 μL倍比稀釋的氟康唑，依次加96孔板的第2～11列；由低濃度到高濃度的順序，取50 μL 倍比稀釋的鹽酸小檗堿藥液，依次加入96孔板的第 B～H 行.除A12孔之外，向其他各孔加入100 μL菌懸液，并加沙氏培養(yǎng)液于少于200 μL 液體的孔.其中，H1孔為生長對(duì)照孔，A12孔為空白對(duì)照孔.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，調(diào)節(jié)菌濃度為1×105CFU/mL，37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)24 h，以O(shè)D值測定法判讀結(jié)果.上述各藥物孔中溶劑DMSO 終濃度均不超過1%，可忽略其對(duì)菌體的影響.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

2.2.2 OD值測定法

用酶標(biāo)儀讀取各孔在波長 625 nm 處的OD值[18].真菌生長抑制百分?jǐn)?shù)的計(jì)算方法為：真菌生長抑制百分?jǐn)?shù)=1-(各孔中的OD值-空白對(duì)照孔中的OD值)/(生長對(duì)照孔中的OD值-空白對(duì)照孔中的OD值)×100%.

MIC80值的判定 MIC80=10^(log(A)+(a-80)/(a-b)×log(1/N))，其中A為真菌生長抑制百分?jǐn)?shù)大于80%對(duì)應(yīng)上述梯度濃度中的最小濃度，a為A對(duì)應(yīng)的真菌生長抑菌百分?jǐn)?shù)，b為僅小于a的真菌生長抑制百分?jǐn)?shù)，N為稀釋倍數(shù).

2.2.3 2種藥物聯(lián)合作用效果評(píng)價(jià)方法

本實(shí)驗(yàn)采用 FICI法對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià).該法是以 Loewe additivity(LA)理論為基礎(chǔ)發(fā)展出的非參數(shù)法模型.其公式為FICI=MICA/A+MICB/B (FICI：部分抑菌聯(lián)合指數(shù)). 式中A和B分別為兩藥單用時(shí)的MIC值，MICA和MICB為兩藥聯(lián)合時(shí)的MIC值. 當(dāng)MIC值高于檢測最高限時(shí)以做高限濃度的兩倍值用以計(jì)算FICI.本實(shí)驗(yàn)中MIC80值的計(jì)算以氟康唑的最小真菌生長80%時(shí)的抑制百分?jǐn)?shù)來計(jì)算.FICI法則是最為常用的解釋抗真菌藥物相互作用的模型，但不同文獻(xiàn)對(duì)于FICI值的解讀尚存在多種標(biāo)準(zhǔn)，我們?cè)诒疚闹胁捎谩癋ICI≤0.5為協(xié)同作用,0.54為拮抗作用的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定[14-15,19-20].

2.3 倍比微量稀釋法

2.3.1 操作步驟

將氟康唑和鹽酸小檗堿儲(chǔ)備液用沙氏液體培養(yǎng)基分別稀釋至終質(zhì)量濃度為128 μg/mL和64 μg/mL，取無菌96孔板，第1排不加沙氏液體培養(yǎng)基，其余每排中加入100 μL的沙氏液體培養(yǎng)基，于A行加入256 μg/mL的氟康唑藥液和128 μg/mL的鹽酸小檗堿藥液，各3個(gè)重復(fù)孔，每孔125 μL；聯(lián)合用藥組每孔加入512 μg/mL的氟康唑和256 μg/mL的鹽酸小檗堿藥液各62.5 μL，終體積125 μL，各3個(gè)重復(fù)孔；A行每孔吸取25 μL加到B行中，混勻后吸取25 μL到C行中，以此類推到F行，混勻后棄掉25 μL，在A-F行間形成5倍倍比稀釋.最后每孔加入100 μL的菌懸液，使菌液濃度為1×105CFU/mL.另設(shè)只加菌液和培養(yǎng)液為陽性對(duì)照和只加沙氏培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，各3個(gè)重復(fù)孔.上述各藥物孔中溶劑DMSO 終濃度均不超過1%，可忽略其對(duì)菌體的影響.37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)24 h，以O(shè)D值測定法判讀結(jié)果.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.其MIC80計(jì)算同上述棋盤法.

2.3.2 2種藥物聯(lián)合作用效果評(píng)價(jià)方法

同上述棋盤法.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 棋盤法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

棋盤法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：氟康唑和鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌耐藥株23# 單獨(dú)運(yùn)用時(shí)，其MIC80大于藥物的最大濃度，聯(lián)合運(yùn)用時(shí)，降低了氟康唑和鹽酸小檗堿的MIC80，菌株對(duì)氟康唑的敏感性增強(qiáng)，由耐藥(MIC80≥128)變得敏感，聯(lián)用后氟康唑的MIC80在0.5到1之間，同時(shí)鹽酸小檗堿的MIC80降到了25 μg/mL以下(表1).以MIC80值為基礎(chǔ)兩藥聯(lián)合后其FICI值均小于0.5，兩藥之間為協(xié)同作用.

表1 氟康唑和鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌的MIC80和FICI

3.2 倍比微量稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

倍比微量稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：氟康唑和鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌耐藥株23# 單獨(dú)用藥時(shí)，氟康唑和小檗堿的MIC80均大于藥物的最大濃度，兩藥聯(lián)合之后，菌株對(duì)氟康唑的敏感性增強(qiáng)，聯(lián)合后氟康唑和鹽酸小檗堿的MIC80均降低(表2). 以MIC80為基礎(chǔ)，藥物的FICI值小于0.5，兩藥之間為協(xié)同作用.

表2 氟康唑和鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌的MIC50和FICI

注：2種方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合.

4 討論

棋盤法和倍比微量稀釋法均是根據(jù)真菌在不同藥物濃度配比中生長程度不同，來獲得MIC80，并計(jì)算FICI值，從而判斷兩藥之間的相互作用.棋盤法是目前國際上測定并評(píng)價(jià)藥物體外聯(lián)合作用效果時(shí)使用最廣泛、最公認(rèn)的方法，濃度組合多，能精確測定2種抗菌藥物在在適當(dāng)濃度的比例下的相互作用，數(shù)據(jù)較多，信息較全，更適合全面評(píng)價(jià)兩藥之間的相互作用，較為適用于未知MIC值兩藥聯(lián)合用藥的篩選，但其MIC值判定多用肉眼觀察法，受主觀因素影響較大，且不能定量地記錄結(jié)果，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏一定的準(zhǔn)確性和客觀性.故本實(shí)驗(yàn)中以酶標(biāo)儀測定OD值的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，通過透光率來反映真菌的生長情況，具有客觀、定量、迅速簡便、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確[21].

倍比微量稀釋法操作簡單，濃度組合少，雖然數(shù)據(jù)量較小，但可減少工作量.我們實(shí)驗(yàn)中用棋盤法和倍比微量稀釋法檢測氟康唑和鹽酸小檗堿聯(lián)合應(yīng)用對(duì)白色念珠菌耐藥株23# 的活性，2種方法均能驗(yàn)證氟康唑和鹽酸小檗堿聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合，說明2種方法均能作為抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用的篩選方法.我們發(fā)現(xiàn)對(duì)棋盤法所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行MIC80的計(jì)算時(shí)，真菌生長抑制百分?jǐn)?shù)的選擇會(huì)受到主觀因素的影響，存在多重標(biāo)準(zhǔn)，如圖1 中3組圈內(nèi)數(shù)據(jù)均可分別用來計(jì)算兩藥的MIC80值，不同的真菌生長抑制百分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的MIC80值結(jié)果差距很大，其FICI值(部分抑菌聯(lián)合指數(shù))也會(huì)有很大的不同，存在多重標(biāo)準(zhǔn)，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性較差.同時(shí)棋盤法中每個(gè)濃度組合只有一個(gè)孔，操作誤差也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定.

而倍比微量稀釋法中MIC80的計(jì)算只有一種標(biāo)準(zhǔn)(見圖2中圈內(nèi)數(shù)據(jù))，其FICI值的結(jié)果也就更具有客觀性和準(zhǔn)確性；且倍比微量稀釋法中每個(gè)質(zhì)量濃度配合有3個(gè)孔，可減小操作誤差.本實(shí)驗(yàn)中規(guī)定以氟康唑的真菌生長抑制百分?jǐn)?shù)大于80%所對(duì)應(yīng)的最小濃度來計(jì)算其MIC80值.

綜上所述，棋盤法和倍比微量稀釋法均能用于抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用的篩選，但2個(gè)方法相比較，倍比微量稀釋法具有以下優(yōu)點(diǎn)：①操作簡單，節(jié)省時(shí)間；②在選擇MIC80計(jì)算FICI值時(shí)只有一種標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為客觀；③每個(gè)濃度組合有3個(gè)重復(fù)孔，可有效減小誤差.故我們認(rèn)為倍比微量稀釋法更適合用于與已知抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用藥物的快速通量篩選.