基于斑馬魚胚胎模型的抗腫瘤藥物毒性評(píng)價(jià)方法

程祖春，趙海山,馮啟榮,孫婷偉,譚文

(1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006)

抗腫瘤藥物(anti-tumor drug)在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞造成損害，因此導(dǎo)致顯著的毒副作用。毒副作用主要表現(xiàn)為：心臟、肝臟、腎臟毒性，骨髓抑制及胃腸道黏膜受損等，其中心臟毒性是最主要的因素，是限制其廣泛使用的主要原因[1]。藥物從設(shè)計(jì)合成到臨床使用的整個(gè)研究階段，毒副作用是藥物研發(fā)失敗的主要因素。即便是上市后仍有許多藥物因?yàn)槊黠@的心血管毒性被撤出市場或嚴(yán)格限制使用。

目前已有多類抗腫瘤藥物被證明具有顯著的心臟毒性。比如，以阿霉素(Doxorubicin，Dox)為代表的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，在臨床應(yīng)用上發(fā)現(xiàn)其會(huì)引起嚴(yán)重的心臟毒性，這種心臟毒性與藥物累計(jì)用量相關(guān)，常導(dǎo)致化療療程被迫中斷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重心力衰竭并死亡[2-5]。此外，多種多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)類藥物也存在嚴(yán)重的心臟毒性，如蘇尼替尼(Sunitinib，Sun)與索拉非尼(Sorafenib，Sor)，它們通過抑制PDGFR及VEGFR等酪氨酸激酶受體，抑制腫瘤血管新生而起到抗腫瘤作用。但同時(shí)也導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管毒性，包括高血壓、心衰、心律失常、急性冠狀動(dòng)脈綜合征和心肌梗死等[6-11]。

因此，對(duì)抗腫瘤藥物的心血管毒性進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的高通量篩選與安全性評(píng)價(jià)，是減少臨床心血管毒副作用的重要手段，同時(shí)為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。目前，藥物安全性評(píng)價(jià)模型主要有體內(nèi)和體外2大類型。一類是以細(xì)胞為代表的體外模型，雖可進(jìn)行高通量篩選，但不能模擬動(dòng)物的整體生理過程；第二是以小鼠為代表體內(nèi)模型，可從整體評(píng)價(jià)藥物的毒性作用，但受到周期、費(fèi)用、法律等諸多因素限制。因此，尋找一種快速、高效、直觀可進(jìn)行活體監(jiān)測(cè)的藥物毒性評(píng)價(jià)模型成為迫切需求。

斑馬魚(zebrafish)作為整體動(dòng)物模型，它具有產(chǎn)卵多、體外受精發(fā)育、胚胎透明等優(yōu)點(diǎn)[12]，便于活體觀測(cè)心血管系統(tǒng)的表型改變。已經(jīng)成為繼小鼠之后藥物毒性評(píng)價(jià)的重要模式生物，尤其在心血管研究領(lǐng)域，有非常成熟和廣泛的應(yīng)用[13]。Liu等[14]使用Dox誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎心臟毒性模型，從3 000個(gè)化合物中篩選出2個(gè)(VIS和DPU)具有明顯改善Dox心臟毒性的化合物。Sarathd等[15]使用MPTP在斑馬魚胚上誘導(dǎo)帕金森疾病模型，用于篩選具有潛在治療帕金森疾病的化合物。Cao等[16]在斑馬魚胚胎上評(píng)估福美鋅(ziram)對(duì)胚胎發(fā)育的影響，通過評(píng)價(jià)存活率、心率、胚胎形態(tài)、行為、分子等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。Jin等[17]使用Tg[flk:EGFP]品系斑馬魚建立腫瘤異種移植模型來評(píng)價(jià)抗腫瘤藥貝伐單抗、恩度和阿帕替尼的功效、安全性和腫瘤抑制作用。

因此，本研究選用Tg[myl7:EGFP]和Tg[flk:EGFP]轉(zhuǎn)基因系斑馬魚作為研究對(duì)象，建立了抗腫瘤藥物心臟毒性的評(píng)價(jià)體系，評(píng)價(jià)了Dox、Sun、Sor 3種抗腫瘤藥物對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性、心臟毒性、心血管發(fā)育等影響，一方面為未來的進(jìn)一步新藥開發(fā)提供資料及線索，也為其他類型抗腫瘤藥物毒性評(píng)價(jià)提供了可靠的模型。

1 儀器與材料

Stemi 508型體視顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；Axio Imager.2型熒光正置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；Axio Observer A1型熒光倒置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；DHP-9012型恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

Doxorubicin HCl原料藥(Selleck chem，批號(hào)：S120813，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.82%)；Sorafenib(Selleck chem，批號(hào)：S739707，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.89%)；Sunitinib malate原料藥(Selleck chem，批號(hào)：S104207，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.63%)。

Holt buffer 配制如下：量取1 900 mL ddH2O，置于2 L燒杯中，使用攪拌器攪拌，依次加入：7.000 g NaCl，0.400 g NaHCO3，0.100 g KCl和0.235 g CaCl2，ddH2O定容至2 000 mL，并使用一次性真空過濾器(孔徑0.22 μmol/L)過濾，常溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)所用魚品種為Tg[myl7:EGFP]或Tg[flk:EGFP]成年魚齡為6個(gè)月～12個(gè)月，魚系均購于國家斑馬魚資源中心。

2 方法

2.1 溶液的制備

Dox用ddH2O溶解，制備成1 mmol/L的儲(chǔ)備液，分裝于1.5 mL EP管中，避光置于-20 ℃冰箱。

Sor、Sun用DMSO溶解，分別制備成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L儲(chǔ)備液，并分裝于1.5 mL EP管中，避光置于-20 ℃冰箱。

2.2 斑馬魚胚胎的獲取

在實(shí)驗(yàn)前1天下午喂食1 h后，選取健康的成年魚系，雌雄各半，置配種缸中，每缸1對(duì)，并用隔板將雌雄隔開。次日上午9:00，打開隔板，自由交配后1 h后收集胚胎，挑選發(fā)育正常受精卵于培養(yǎng)皿中，加入適量Holt buffer培養(yǎng)液，每皿不超過100枚胚胎，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 斑馬魚胚胎的急性毒性

取24hpf(受精后小時(shí))的AB系野生型斑馬魚胚胎，分成若干組，置于96孔板中，每孔1枚，每組20孔。用Holt buffer培養(yǎng)液按體積比稀釋成不同濃度的Dox溶液，使終濃度分別為0、20、40、50、60、70、80 μmol/L。

同時(shí)，Holt buffer培養(yǎng)液按體積比稀釋成不同濃度的Sor、Sun溶液，使終濃度分別為0、5、10、15、20、25、30 μmol/L。并設(shè)置1%DMSO溶劑對(duì)照組，每孔加入100 μL，24 h后再加入100 μL藥液。將96孔板置于28 ℃恒溫配養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天于倒置顯微鏡下觀察并記錄胚胎的存活狀況，以胚胎心臟停止跳動(dòng)或者卵凝結(jié)為死亡判定標(biāo)準(zhǔn)。最后，統(tǒng)計(jì)藥物處理24、48、72 h的胚胎存活率，并作存活率曲線，計(jì)算LC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.4 斑馬魚胚胎心臟功能的評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物對(duì)胚胎的整體毒性，選擇胚胎藥物暴露處理48 h(即72hpf)。取24hpf(受精后)的Tg[myl7:EGFP]轉(zhuǎn)基因魚系胚胎60枚，分成18組，每組15枚，置于24孔板中。用Holt buffer培養(yǎng)液分別將Dox、Sor、Sun稀釋至5、10、15 μmol/L。藥物處理48 h后，即72hpf時(shí)，用Holt buffer胚胎培養(yǎng)液洗清洗3次，以去除藥液。在凹面載玻片上滴加1滴3%的甲基纖維素固定溶液，以固定胚胎。然后將胚胎置于固定液上，于體式顯微鏡下并調(diào)整好胚胎的位置，將兩眼保持重合，身體保持平直。在10×正置熒光顯微鏡下，選用EGFP通道找到心臟位置，計(jì)數(shù)15 s心跳次數(shù)，最后×4計(jì)算每分鐘心率。

同時(shí)，使用錄像功能對(duì)胚胎心臟位置進(jìn)行錄像，保存視頻。視頻使用Adobe Premiere視頻軟件逐幀播放，找到同一周期內(nèi)心臟舒張和收縮時(shí)的那一幀，導(dǎo)出圖片。然后用Photoshop測(cè)量工具對(duì)舒張和收縮末期心室內(nèi)徑進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算收縮分?jǐn)?shù)(fractional shortening，F(xiàn)S)；并測(cè)量靜脈竇到動(dòng)脈球之間的距離，以計(jì)算靜脈竇-動(dòng)脈球(SV-BA)的間距。實(shí)驗(yàn)每次選取10只進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 斑馬魚胚胎血管發(fā)育的評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物對(duì)胚胎血管發(fā)育的影響，選擇胚胎藥物暴露處理48 h(即72hpf)。取24hpf(受精后小時(shí))的Tg[flk:EGFP]轉(zhuǎn)基因魚系胚胎60枚，分成4組，每組15枚，置于24孔板中。用Holt buffer培養(yǎng)液分別將Dox、Sor、Sun稀釋至5 μmol/L。藥物處理48 h后，即72hpf時(shí)，用Holt buffer胚胎培養(yǎng)液洗清洗3次，以去處藥液。在凹面載玻片上滴加一滴3%的甲基纖維素固定溶液，以固定胚胎。然后將胚胎置于固定液上，于體式顯微鏡下并調(diào)整好胚胎的位置，將兩眼保持重合，身體保持平直。最后，將玻片置于5×正置熒光顯微鏡下，選用EGFP通道對(duì)胚胎進(jìn)行拍照，每組選取5～8只。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 胚胎急性毒性

結(jié)果表明，DMSO溶劑組對(duì)胚胎存活率無明顯影響。胚胎經(jīng)不同濃度的Dox、Sor、Sun處理24 h后(即48hpf)，其存活數(shù)量與對(duì)照組比較無明顯改變；處理48 h后(即72hpf)后，Dox組存活率與對(duì)照組比較無明顯改變，而Sor與Sun處理組存活率開始明顯下降；處理72 h后(即96hpf)，各組胚胎均有明顯的死亡，胚胎存活率隨著Dox、Sor、Sun濃度的增加而顯著降低，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性(圖1B-D)。3種抗腫瘤藥物Dox、Sor、Sun對(duì)96hpf胚胎的LC50值分別為51.56、12.98、19.10 μmol/L(表1)。由此，比較出3種抗腫瘤藥對(duì)斑馬魚胚胎毒性的順序?yàn)椋篠or>Sun>Dox。

3.2 斑馬魚胚胎的整體毒性

對(duì)照組胚胎發(fā)育正常，脫膜孵化為幼魚，心臟呈S形，側(cè)面觀察心室和心房部分重疊，心血管系統(tǒng)無形態(tài)學(xué)改變(圖2A)。5 μmol/L Dox處理組胚胎發(fā)育基本正常，體節(jié)間血流循環(huán)正常，卵黃略有縮小，無可見心血管系統(tǒng)形態(tài)學(xué)改變；10 μmol/L Dox處理組胚胎出現(xiàn)輕微心包膜水腫，血流緩慢、心臟輕微畸形；15 μmol/L Dox處理組胚胎血流緩慢或者無背部血流，卵黃囊出血、并有明顯凹陷，房室瓣受損、血液返流，心臟功能受阻(圖2B)。

A.胚胎處理方法； B.Dox組； C.Sor組； D.Sun組。

圖13種抗腫瘤藥物對(duì)48hpf、72hpf、96hpf胚胎存活率的影響

Figure1Effect of three anti-tumor drugs on the survival rate of 48hpf,72hpf and 96hpf embryos

表196hpf斑馬魚胚胎急性毒性LC50值

Table1Acute toxicity LC50value of 96hpf zebrafish embryo

組別LC50/(μmol·L-1)95%置信區(qū)間/(μmol·L-1)Dox51.5642.49～62.58Sor12.989.72～17.35Sun19.1015.88～23.05

5 μmol/L Sor處理組胚胎出現(xiàn)明顯的心包水腫，卵黃囊變小，心臟畸形且線性化、心室變小、體節(jié)間血流緩慢或無血液循環(huán)等多種形態(tài)改變；隨著濃度的增加，胚胎整體毒性越顯著，10 μmol/L Sor處理組胚胎呈現(xiàn)顯著心包水腫，卵黃囊明顯凹陷，心臟嚴(yán)重畸形且線性化、心房與心室變小、血流緩慢或無血液循環(huán)等多種形態(tài)改變；15 μmol/L Sor時(shí)，胚胎心包囊腫，卵黃囊凹陷變小，體長縮短、體節(jié)發(fā)育異常、脊柱彎曲，短尾卷曲，心臟畸形，體節(jié)間血管無血液循環(huán)，胚胎生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響(圖2C)。

5 μmol/L Sun處理組出現(xiàn)輕微心包水腫，體節(jié)間血流緩慢，卵黃囊出血并有明顯凹陷；隨著濃度的增加，胚胎整體毒性越顯著，10 μmol/L Sun時(shí)出現(xiàn)明顯的心包水腫，心臟畸形且線性化、心室變小、體節(jié)間無血液循環(huán)等；當(dāng)濃度為15 μmol/L Sun時(shí)，胚胎整體出現(xiàn)多種形態(tài)學(xué)的改變，卵黃囊水腫、出血，心臟線性化，房室瓣缺損、無血流循環(huán)，體長縮短、體節(jié)發(fā)育異常、脊柱彎曲等(圖2D)。

A. Control組； B. Dox組； C. Sor組； D. Sun組。

圖2不同濃度的Dox、Sor、Sun對(duì)72hpf胚胎整體發(fā)育的影響

Figure2Effect of different concentrations of Dox,Sor and Sun on the overall development of 72hpf embryos

3.3 斑馬魚胚胎的心臟毒性

為評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物對(duì)斑馬魚胚胎心功能的影響，本部分實(shí)驗(yàn)心臟特異性表達(dá)綠色熒光蛋白的Tg[myl7：EGFP]轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，對(duì)胚胎整體毒性及心臟毒性進(jìn)行直觀可靠的評(píng)價(jià)。

斑馬魚胚胎分別經(jīng)不同濃度的Dox、Sor、Sun處理48 h，到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，用Holt buffer洗去藥液，并于正置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)胚胎心跳次數(shù)。顯微鏡選取EGFP通道，對(duì)胚胎進(jìn)行拍照和心臟位置錄像。并用Photoshop測(cè)量心室舒張和收縮末期短軸內(nèi)徑，以計(jì)算FS。

胚胎在暴露于3種不同濃度抗腫瘤藥物48 h后，心臟結(jié)構(gòu)線性化，心室縮短分?jǐn)?shù)(FS)、心率和體長顯著降低(圖3B-G)。對(duì)照組心臟結(jié)構(gòu)物明顯改變(圖3A)。對(duì)照組72hpf胚胎心房、心室跳動(dòng)規(guī)則，心室收縮分?jǐn)?shù)為(22.53±3.14)%、心率平均為(96.6±13.8)次/分。隨著Dox、Sor、Sun濃度的升高，胚胎收縮功能和心率顯著降低，呈現(xiàn)明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。

Dox各濃度處理組FS分別為：(16.31±3.26)%、(14.89±3.49)%、(11.03±2.72)%；Sor各濃度處理組FS分別為：(10.72±3.48)%、(8.33±2.19)%、(7.15±3.38)%；Sun各濃度處理組FS分別為：(13.17±3.02)%、(8.54±2.36)%、(5.86±2.74)%(圖3E、F)。與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Dox各濃度處理組心率分別為：(79.2±10.8)、(67.2±18.96)、(58.2±16.56)次/分；Sor各濃度處理組心率心率分別為：(48±15.6)、(41.4±12.72)、(28.8±6.24)次/分；Sun各濃度處理組心率分別為：(67.2±9.6)、(58.2±17.17)、(46.8±15.6)次/分(圖3E、F)。與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Dox個(gè)濃度處理組對(duì)SV-BA間距無顯著影響；Sor各處理組SV-BA顯著增加(P<0.001)；而Sun 5 μmol/L處理組隊(duì)SV-BA無影響，當(dāng)濃度為10 μmol/L 和15 μmol/L 時(shí)，SV-BA間距變長(P<0.05)。

綜上，3種抗腫瘤藥物對(duì)胚胎毒性的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篠or>Sun>Dox。

3.4 斑馬魚胚胎的血管發(fā)育的影響

為評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物對(duì)斑馬魚胚胎血管發(fā)育的影響，采用血管特異性表達(dá)綠色熒光蛋白的Tg[flk:EGFP]轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。斑馬魚胚胎分別經(jīng)5 μmol/L Dox、Sor、Sun處理48 h，到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，用Holt buffer洗去藥液，于正置熒光顯微鏡下對(duì)胚胎拍照。

結(jié)果如圖4所示。對(duì)照組胚胎血管發(fā)育正常，可觀察到發(fā)育正常的血管結(jié)構(gòu)。體節(jié)間血管(intersgmental blood vessels,ISVs)從背部主動(dòng)脈側(cè)(dorsal aorta,DA)或后主靜脈(postrrior cardinal vein,PCVs)延伸到縱向背側(cè)吻合血管(dorsal longitudinal anastomotic vessels,DLAVS)(圖4A)。5 μmol/L Dox處理組對(duì)血管發(fā)育有輕微的損傷，表現(xiàn)為體節(jié)間血管變細(xì)，內(nèi)皮細(xì)胞受損(圖4B箭頭)。Sor處理組對(duì)血管發(fā)育有明顯的抑制，表現(xiàn)為ISV和DLAV完全被抑制，背部主動(dòng)脈血管受損便薄，體節(jié)間未可見血管生成。同時(shí)，胚胎頭部血管明顯減少(圖4C)。Sun處理同樣表現(xiàn)出明顯的抑制作用，體節(jié)間只有少數(shù)血管生成，未見DLAV生成。同時(shí)，胚胎頭部血管明顯減少(圖4D)。

A. Control組； B. Dox組； C. Sor組； D. Sun組； E. FS； F.心率； G.SV-BA間距。與Control組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖3不同濃度的Dox、Sor、Sun對(duì)72hpf胚胎心臟功能的影響

Figure3Effect of different concentrations of Dox,Sor and Sun on the contractile function of 72hpf embryos

A. Control 組； B. 5 μmol/L Dox組； C. 5 μmol/L Sor組； D. 5 μmol/L Sun組。

圖4Dox、Sor、Sun對(duì)胚胎血管發(fā)育的影響

Figure4Effect of Dox,Sor and Sun on embryonic vascular development

4 討論

心血管毒性是抗腫瘤藥物最常見的不良反應(yīng)，也是限制抗腫瘤藥物廣泛使用的主要因素。然而，長期以來缺乏快速、高效、直觀的整體動(dòng)物毒性評(píng)價(jià)模型。因此，尋找一種兼具體內(nèi)和體外模型優(yōu)點(diǎn)，又可快速進(jìn)行高通量篩選藥物心血管毒性的模型成為毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

斑馬魚作為整體動(dòng)物模型，具有體外受精發(fā)育、產(chǎn)卵量高、周期短、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物毒性的高通量篩選評(píng)價(jià)[18]。而其胚胎期全身透明，因此在顯微鏡下可直接觀察心血管系統(tǒng)的形態(tài)變化，以評(píng)價(jià)藥物對(duì)各個(gè)組織器官的毒性。同時(shí)，斑馬魚有非常多熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因魚系，可對(duì)組織器官進(jìn)行熒光標(biāo)記，有利于顯微鏡成像，更加直觀便捷地對(duì)胚胎的組織器官發(fā)育進(jìn)行評(píng)價(jià)[19-20]。

本研究選擇了蒽環(huán)類抗腫瘤藥物中的代表Dox，以及TKIs類的Sun及Sor進(jìn)行研究。其中，Dox的抗腫瘤機(jī)制表現(xiàn)：第一，Dox干擾轉(zhuǎn)錄過程，通過插入到DNA堿基鏈中，抑制RNA的生成，而阻斷DNA的復(fù)制，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物[21]；第二，Dox同時(shí)也抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TOP2)，觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，在快速增值和高表達(dá)TOP2的細(xì)胞中最有效[22]。但是，Dox也同樣造成心肌細(xì)胞DNA損傷，增加氧化壓力，誘導(dǎo)炎癥，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重可造成心衰及死亡，最終限制了其在臨床上的廣泛使用[23-24]。

以Sun及Sor為代表的TKIs類抗腫瘤藥物，通過抑制血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)和血小板衍生生長因子受體(PDGFR)參與腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成，從而起到對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[25-28]。Sun可引起左心室射血分?jǐn)?shù)降低和充血性心力衰竭(congestive heart failure,CFH)，兩種情況的發(fā)生率分別為11%和8%。Sor可引起缺血性心臟病，其中包括心肌梗死(發(fā)生率約3%)[29]。Sun和Sor均可導(dǎo)致心房血栓和高血壓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高[30]。

本研究結(jié)果表明：在急性毒性方面，3種抗腫瘤藥物均明顯降低了胚胎的存活率。Dox、Sor、Sun對(duì)96hpf胚胎的LC50值分別為51.56、12.98、19.10 μmol/L。在心血管毒性方面：抗腫瘤藥物處理的胚胎出現(xiàn)嚴(yán)重的心包水腫、心臟畸形且線性化、心室變小、卵黃囊明顯凹陷，體長縮短、體節(jié)發(fā)育異常、脊柱彎曲、短尾卷曲、體節(jié)間血流緩慢或無血液循環(huán)等多種形態(tài)改變。隨著濃度的身高，胚胎心率、心臟FS顯著降低，心臟功能嚴(yán)重受損，同時(shí)SV-BA間距變長。

在血管發(fā)育方面：對(duì)照組胚胎血管發(fā)育正常，可觀察到發(fā)育正常的血管結(jié)構(gòu)。Dox處理組未對(duì)血管發(fā)育產(chǎn)生明顯影響，這與Dox抗腫瘤作用機(jī)制吻合；而Sor和Sun均明顯抑制血管生成，與其通過抑制VEGF/VEGFR通路參與腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成的機(jī)制吻合。

綜上所述，可見Sor及Sun的LC50顯著低于Dox。而在相同劑量濃度下，Sor及Sun對(duì)心臟功能及結(jié)構(gòu)的影響均大于Dox，而Sor的毒性較Sun更為明顯。這些結(jié)果表明了Sor及Sun的心臟毒性較Dox更強(qiáng)。由于目前臨床上對(duì)Sor及Sun的毒副作用的關(guān)注主要集中在消化系統(tǒng)的不良反應(yīng)上，本研究結(jié)果提示，在臨床上可能需要更進(jìn)一步重視這類藥物潛在的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。