芝麻素聯(lián)合順鉑抗肺癌細(xì)胞H460的作用機(jī)制研究

劉冰，陳岳銘，李華超

(廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

肺癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一且其發(fā)病率呈不斷上升的趨勢(shì)，其中，非小細(xì)胞肺癌占據(jù)了85%的肺癌病例[1-2]。化療仍是肺癌主要的治療方法，然而目前對(duì)肺癌的化療存在有效率不高，副作用較大的缺陷，故從天然植物中提取有效成分作為輔助用藥來(lái)提高化療療效并減少不良反應(yīng)也成為了一種新的抗癌方案[3]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，研究表明，Akt在癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁組織[4]，Akt的過(guò)表達(dá)與肺癌的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)[5]。因此Akt也許是治療肺癌的一個(gè)新的靶點(diǎn)。芝麻素是芝麻籽油中含量最豐富的木脂素，研究表明芝麻素具有抗高血壓、抗血栓形成及抗高膽固醇血癥的特性[6]。另外，在受試者中證實(shí)了芝麻素是安全且可耐受的[7]。已有研究顯示芝麻素的抗腫瘤作用[8]，但有關(guān)芝麻素與順鉑聯(lián)用對(duì)肺癌的抑制作用仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究以人肺癌細(xì)胞H460為研究對(duì)象，觀察芝麻素與順鉑聯(lián)合給藥對(duì)H460細(xì)胞增殖的抑制作用。

1 材料與儀器

1.1 材料

人肺癌細(xì)胞H460細(xì)胞株購(gòu)自ATCC

1.2 主要試劑與儀器

芝麻素、順鉑(Selleckchem)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；Mulitiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；抗體p-Akt(ser473)、β-tubulin(美國(guó)CST公司)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

H460使用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基中均含有10%(φ)胎牛血清(FBS)，在37 ℃含有5%(φ))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用的芝麻素溶于DMSO備用，順鉑溶于DMF備用。

2.2 增殖抑制實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞株H460細(xì)胞，經(jīng)蛋白胰酶消化，以每孔4×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)過(guò)夜，棄去原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL稀釋的不同濃度(5、10、15、20、25、30、40 μmol/L)的芝麻素、順鉑或兩者聯(lián)用，對(duì)照組加入RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL稀釋的DMSO，空白對(duì)照組不加細(xì)胞僅加RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h后，吸干培養(yǎng)基，每孔100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基加入20 μL MTT，置37 ℃，5%(φ)CO2培養(yǎng)箱中避光孵育4 h后，吸干培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，搖床搖10 min后在酶標(biāo)儀563 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值(A)。抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/(溶劑對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100%。

2.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)H460細(xì)胞中p-Akt蛋白的表達(dá)。將細(xì)胞接種于6孔板中，加入不同濃度(10、20、30 μmol/L)芝麻素處理12 h后，在每孔細(xì)胞中加入100 μL的蛋白裂解液后，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算每個(gè)泳道的上樣量為70 μg總蛋白，計(jì)算5× loading buffer量及超純水量，定量，變性。蛋白在10%SDS/PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用TBST洗膜3次后，用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，加入稀釋好的一抗p-Akt(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST洗膜3次后，加入稀釋好的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h后，用TBST洗膜3次，然后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，暗房曝光、顯影、定影。

2.4 協(xié)同指數(shù)(CI)

芝麻素與順鉑之間的相互作用由協(xié)同指數(shù)(CI)來(lái)確定，根據(jù)公式：CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2，(Dx)1、(Dx)2分別表示給定的抑制率所需的芝麻素劑量和順鉑的單獨(dú)劑量。(D)1 和(D)2是芝麻素或順鉑產(chǎn)生相同效果所必需的劑量。芝麻素與順鉑的聯(lián)合作用表示如下：CI<1，協(xié)同作用，CI=1，加和效應(yīng)，CI>1，拮抗作用。劑量降低指數(shù)DRI由協(xié)同指數(shù)中劑量降低的水平來(lái)確定，(DRI)1=(Dx)1/ (D)1；(DRI)2=(Dx)2/(D)2。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 芝麻素對(duì)H460細(xì)胞增殖的抑制作用

當(dāng)芝麻素的給藥濃度為5、10、15、20、25、30、40 μmol/L 7個(gè)濃度時(shí)，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，芝麻素在48 h對(duì)H460細(xì)胞增殖的抑制率均強(qiáng)于24 h。當(dāng)濃度≥10 μmol/L時(shí)，芝麻素對(duì)H460細(xì)胞抑制率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在一定的濃度范圍內(nèi)，芝麻素對(duì)H460細(xì)胞增殖的抑制率隨著藥物濃度的升高而升高，且有劑量依賴性(圖1)。

3.2 芝麻素對(duì)H460細(xì)胞p-Akt表達(dá)的影響

當(dāng)芝麻素的給藥濃度為10、20、30 μmol/L，孵育12 h后，從Western blot結(jié)果可以看出，芝麻素可抑制H460細(xì)胞p-Akt的表達(dá)，且呈劑量依賴性(圖2)。

與24 h對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； 與48 h對(duì)照組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

圖1不同濃度芝麻素對(duì)H460細(xì)胞增殖的影響

Figure1Effect of sesamin at different concentrations on the proliferation of H460 cells

圖2不同濃度的芝麻素對(duì)p-Akt表達(dá)的影響

Figure2Effect of sesamin at different concentrations onp-Akt expression

3.3 順鉑聯(lián)合芝麻素對(duì)H460細(xì)胞增殖的影響

從給藥48 h后的MTT結(jié)果可以看出，當(dāng)順鉑(3 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(15 μmol/L)給藥時(shí)，聯(lián)合給藥組對(duì)H460細(xì)胞增殖抑制效果要強(qiáng)于順鉑(6 μmol/L)或芝麻素(30 μmol/L)給藥組。說(shuō)明順鉑(3 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(15 μmol/L)給藥存在協(xié)同效應(yīng)(圖3)。

3.4 順鉑聯(lián)合芝麻素對(duì)H460細(xì)胞增殖抑制的協(xié)同效應(yīng)

從Fa-CI plot圖可以看出，順鉑(0.75 μmol/L)與芝麻素(4 μmol/L)聯(lián)合使用時(shí)，CI值>1，提示兩者在此濃度下不存在協(xié)同效應(yīng)。另外，順鉑(1.5 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(8 μmol/L)、順鉑(3 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(16 μmol/L)、順鉑(6 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(32 μmol/L)、順鉑(12 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(64 μmol/L)4個(gè)給藥組的CI均<1，提示在順鉑(1.5～12 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(8～64 μmol/L)此范圍內(nèi)，對(duì)H460細(xì)胞增殖抑制效果存在協(xié)同效應(yīng)(圖4)。

與不加藥對(duì)照組比較：**P<0.01； 與順鉑(6 μmol/L)比較：#P<0.05; 與芝麻素(30 μmol/L)比較:+P<0.05。

圖3單用芝麻素/順鉑或芝麻素聯(lián)合順鉑對(duì)H460細(xì)胞增殖的影響

Figure3Effect of sesamin,cisplatin or combination of both on the viability of H460 cells

圖4順鉑聯(lián)合芝麻素對(duì)H460細(xì)胞增殖抑制的協(xié)同效應(yīng)

Figure4Synergistic effect of cisplatin and sesamin on anti-proliferation of H460 cells

3.5 順鉑聯(lián)合芝麻素對(duì)p-Akt表達(dá)的影響

從Western blot結(jié)果可以看出，單獨(dú)使用順鉑時(shí)(3 μmol/L)時(shí)，對(duì)p-Akt的表達(dá)無(wú)顯著影響。當(dāng)順鉑(3 μmol/L)聯(lián)合芝麻素(20 μmol/L)時(shí)，可顯著降低p-Akt的表達(dá)(圖5)。

圖5順鉑聯(lián)合芝麻素對(duì)p-Akt表達(dá)的影響

Figure5Effect of cisplatin combined with sesamin onp-Akt expression

4 討論

目前，肺癌治療新技術(shù)不斷呈現(xiàn)，尤其是細(xì)胞分子生物學(xué)及化療藥理學(xué)的迅猛發(fā)展，使得尋找活性強(qiáng)、選擇性強(qiáng)、低毒的抗癌方法成為肺癌治療的發(fā)展方向[9]。中藥單體具有取材方便、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)；西藥具有靶向作用強(qiáng)、見(jiàn)效快的特點(diǎn)[10]。而將中藥單體和西藥聯(lián)合使用抗癌，將兩者有效聯(lián)合在一起，可使其最大限度地發(fā)揮作用。芝麻素是從芝麻籽油中提取出來(lái)的一種木脂素，它對(duì)乳腺癌及肺癌均有顯著的抑制作用[8,11]。順鉑是臨床常用的肺癌化療藥，可抑制腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制過(guò)程，因其抗癌譜廣，作用強(qiáng)而廣泛應(yīng)用，但容易產(chǎn)生耐藥性[12]。從本研究結(jié)果可以看出，順鉑與芝麻素聯(lián)合使用對(duì)肺癌細(xì)胞H460的增殖抑制效果明顯，且兩者聯(lián)合使用可產(chǎn)生協(xié)同作用。

PI3K/Akt信號(hào)通路作為癌細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與許多重要的生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，活化的Akt可影響下游多個(gè)效應(yīng)分子，發(fā)揮促進(jìn)增殖、抑制凋亡的作用，與多種腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展密切相關(guān)[13]。研究表明，在43%～90%的非小細(xì)胞肺癌病例中，均可觀察到癌組織中的p-Akt的表達(dá)水平顯著高于癌周組織[14]。此外，臨床研究表明[15]，激活的Akt通路與肺癌的侵襲性與預(yù)后不良密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，芝麻素可顯著地抑制p-Akt的表達(dá)。單用順鉑(3 μmol/L)對(duì)p-Akt表達(dá)無(wú)影響，而當(dāng)順鉑聯(lián)合芝麻素使用時(shí)，可顯著地抑制p-Akt的表達(dá)(與芝麻素和順鉑產(chǎn)生的協(xié)同作用類(lèi)似)。芝麻素抑制Akt活性的機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)中，順鉑聯(lián)合芝麻素給藥可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，同時(shí)，兩者聯(lián)用時(shí)可協(xié)同抑制p-Akt的表達(dá)，提示順鉑聯(lián)合芝麻素所產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)可能是通過(guò)抑制p-Akt的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由于芝麻素的毒性低且與順鉑聯(lián)合可產(chǎn)生協(xié)同作用，芝麻素可能成為順鉑化療的輔助用藥。