大麻二酚對(duì)應(yīng)激大鼠肺部損傷的預(yù)防保護(hù)作用

葉程龍，余偉，莫斯喻，任建輝，趙春鶴，臧林泉

(廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

應(yīng)激反應(yīng)是由各種應(yīng)激源引起的個(gè)體非特異性反應(yīng)，處于應(yīng)激狀態(tài)下的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)主要依賴于腎素-血管緊張素系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)的激活。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)急性應(yīng)激障礙大鼠腦組織產(chǎn)生過多自由基產(chǎn)生腦損害[1]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明：在較為強(qiáng)烈的急性應(yīng)激環(huán)境下大鼠肺部會(huì)出現(xiàn)一定程度的損傷，這可能是源于HPA軸的過度持續(xù)激活導(dǎo)致外周激素的分泌紊亂。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是提取自植物大麻的一種化學(xué)成分，它和四氫大麻酚(THC)是自大麻植物中分離得到含量最高的2種大麻素[2]。CBD和THC在神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)、抗炎抗氧化以及抗腫瘤方面具有很大的藥用價(jià)值，所不同的是CBD并沒有THC的致幻成癮作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)CBD可有效調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能障礙降低腦受損功能，對(duì)于緩解抑郁和社交焦慮障礙也有一定作用[4]，這表明CBD可能具備一定的抗應(yīng)激能力，但未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討應(yīng)激大鼠給藥后血清中CORT及肺損傷相關(guān)炎癥因子TNF-α及IL-1β含量變化及CBD對(duì)應(yīng)激大鼠的肺損傷的干預(yù)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

健康雄性8周齡SD大鼠40只，體質(zhì)量180～200 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002。

CBD購自廣州合誠化學(xué)有限公司(批號(hào)：HS-180554)；TNF-α、IL-1β、CORT的ELISA檢測(cè)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號(hào)：12/2018)；OCT包埋劑購自美國Sakura公司；黏附載玻片購自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司；一次性病理刀片購自德國萊卡公司。

1.2 動(dòng)物模型的建立與分組

將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分成5組并按預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置以下劑量：正常對(duì)照組(NS，10 mL/kg)、模型對(duì)照組(NS，10 mL/kg)，低、中、高劑量CBD組(CBD，12 mg/kg、36 mg/kg、108 mg/kg)，每組8只。采取灌胃給藥的方式，各組大鼠在造模前3天開始每日早晚2次灌胃給藥，最后一次給藥結(jié)束后，除正常對(duì)照組外其他組大鼠均采用固定四肢的方式束縛于鼠板，置于20 ℃冷水中進(jìn)行48 h的水浸束縛應(yīng)激，中途短暫解綁休息并使其自由飲水。應(yīng)激結(jié)束后對(duì)各組大鼠進(jìn)行麻醉，然后腹主動(dòng)脈取血，處死后解剖留取肺組織于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

1.3 肺臟器系數(shù)和肺組織濕/干質(zhì)量(W/D)比值的測(cè)定

解剖前使用電子秤稱量大鼠體質(zhì)量。解剖后取大鼠完整肺組織，稍微吸干表面血液后于分析天平稱量全肺質(zhì)量，按臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%公式計(jì)算各組大鼠臟器系數(shù)。再取大鼠右肺上葉于分析天平稱量濕質(zhì)量，將其置于60 ℃烘箱內(nèi)烘烤72 h后取出稱量其干質(zhì)量，計(jì)算濕/干質(zhì)量比值(wet/dry weight ratio)。

1.4 組織病理學(xué)方法檢測(cè)肺組織形態(tài)學(xué)變化

按上述方法稱肺全質(zhì)量后，取左肺于4%(φ)多聚甲醛內(nèi)固定24 h后按常規(guī)方法制作肺組織病理切片，HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.5 ELISA法檢測(cè)血清中CORT、TNF-α、IL-1β水平

大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，室溫下自然放置血液凝固30 min，4 ℃冷凍離心20 min(3 000 r/min)。仔細(xì)吸取上清，-20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定大鼠血清中腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)、皮質(zhì)酮(Corticosterone，CORT)含量，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺臟器系數(shù)及肺組織W/D比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組肺臟器系數(shù)和W/D都明顯高于正常組(P<0.01)。CBD中、高劑量給藥組肺臟器系數(shù)和W/D值與模型組相比都顯著降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性。見表1。

2.2 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較

由HE染色結(jié)果可以看出：正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)正常；模型組肺組織肺泡壁增厚，肺泡間隙變大，肺泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)坍塌并伴有部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，CBD各劑量給藥組肺組織結(jié)構(gòu)的破壞和水腫程度都有減輕，且呈劑量依賴性。各組大鼠肺組織HE染色情況如圖1所示。

2.3 各組大鼠血清中CORT、TNF-α、IL-1β含量比較

ELISA結(jié)果表明：模型組大鼠相較于正常組大鼠，血清中CORT、TNF-α及IL-1β濃度顯著升高。與模型組比較，高劑量CBD給藥組血清中CORT含量顯著下降(P<0.01)，中、高劑量CBD給藥組血清中TNF-α及IL-1β含量顯著下降(P<0.05或P<0.01)且下降程度呈劑量依賴性。各組大鼠CORT、TNF-α、IL-1β血清含量詳見表2。

表1各組大鼠臟器系數(shù)及W/D

組別劑量/(mg·kg-1) 肺臟器系數(shù)/%W/D正常組- 1.395±0.067 4.533±0.339模型組- 1.518±0.053## 6.365±0.413##CBD 低劑量組121.438±0.0906.179±0.402 中劑量組36 1.421±0.051?? 5.860±0.222?? 高劑量組 108 1.397±0.053?? 4.896±0.425??

與正常組比較：##P<0.01； 與模型組比較：**P<0.01。

A．正常組; B.模型組; C.CBD低劑量組; D.CBD中劑量組; E.CBD高劑量組。

與正常組比較：##P<0.01； 與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

應(yīng)激是動(dòng)物應(yīng)對(duì)突變的外界狀況而產(chǎn)生的一種情緒心理狀態(tài)，也是當(dāng)生物受到外界情況的變化時(shí)生物體對(duì)刺激的持續(xù)反饋狀態(tài)，這些刺激可以是物理性的、軀體的，也可以是社會(huì)性的、心理的。處于應(yīng)激狀態(tài)下的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)主要依賴于腎素-血管緊張素系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)的激活，HPA軸主要分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和CORT的水平變化常常被認(rèn)為是判斷應(yīng)激程度的指標(biāo)[5]。在較為強(qiáng)烈的應(yīng)激源如劇烈的精神刺激或持續(xù)困境的作用下，HPA軸的持續(xù)激活會(huì)導(dǎo)致血中皮質(zhì)酮濃度持續(xù)處于高水平狀態(tài)從而打破原有的負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，這將嚴(yán)重影響機(jī)體器官組織的正常運(yùn)作。在本實(shí)驗(yàn)中選擇使用冷水浸泡束縛大鼠的方法意在通過創(chuàng)造一個(gè)對(duì)大鼠窘迫的生存困境，誘使其持續(xù)產(chǎn)生較為強(qiáng)烈的急性應(yīng)激障礙，以模擬現(xiàn)代人群面對(duì)重大突發(fā)情況如失獨(dú)或?yàn)?zāi)難等產(chǎn)生的心理應(yīng)激狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)在應(yīng)激實(shí)驗(yàn)初期大鼠會(huì)產(chǎn)生類似過度通氣的情況，在經(jīng)過一段時(shí)間后的持續(xù)應(yīng)激后其肺部會(huì)出現(xiàn)一定的肺充血現(xiàn)象和少量出血點(diǎn)，病理學(xué)切片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)激會(huì)使得大鼠肺臟局部出現(xiàn)較為明顯的病理學(xué)變化。

近年來，歐美國家對(duì)具有非精神活性成分的大麻提取物CBD的藥理研究和藥物開發(fā)應(yīng)用得到了較大的進(jìn)展，CBD純品的制劑已經(jīng)被用于治療多發(fā)性硬化癥和兒童發(fā)作性癲癇[7]。研究發(fā)現(xiàn)CBD有一定的抗炎抗氧化作用，Ribeiro等[8]證實(shí)單劑量的CBD對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征有一定的保護(hù)作用。近年來有研究表明大腦中的糖皮質(zhì)激素和大麻素受體系統(tǒng)被認(rèn)為是治療壓力相關(guān)疾病的關(guān)鍵[9]，同時(shí)CBD還可有效調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能障礙降低腦受損功能，能一定程度緩解社交焦慮障礙和抑郁[10]。目前國內(nèi)外對(duì)CBD的研究大多數(shù)集中在癲癇等中樞性疾病，本研究發(fā)現(xiàn)CBD可以有效降低應(yīng)激大鼠外周血中CORT、TNF-α及IL-1β水平，該作用目前未見文獻(xiàn)報(bào)道，這提示CBD對(duì)壓力應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用同時(shí)體現(xiàn)在中樞和外周兩方面。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中CORT、TNF-α和IL-1β含量都相比正常對(duì)照組升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CBD高劑量組的血清學(xué)指標(biāo)則相對(duì)模型組有顯著性下降，這說明高劑量的CBD對(duì)大鼠急性應(yīng)激有明顯的對(duì)抗作用。同時(shí)，在給予不同劑量的CBD后組織病理學(xué)切片結(jié)果顯示CBD高劑量組相比模型組，其肺泡壁無明顯增厚且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯降低，這說明CBD對(duì)應(yīng)激大鼠的肺部具有保護(hù)作用。

綜上所述，可初步明確CBD對(duì)應(yīng)激大鼠的肺部損傷有一定的改善作用，尤其以高劑量更為顯著，其機(jī)制可能是通過抑制了HPA軸的激活導(dǎo)致外周CORT分泌的減少，進(jìn)一步下調(diào)了血清TNF-α和IL-1β的表達(dá)，從而減弱肺部炎癥信號(hào)間的傳導(dǎo)間接減少氧化應(yīng)激對(duì)肺部的損傷。從上述實(shí)驗(yàn)可推斷CBD可能是急性應(yīng)激障礙所致肺損傷的潛在治療手段，因此有必要進(jìn)一步對(duì)CBD的外周應(yīng)激相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行更深入的分子機(jī)制研究。