葛根的指紋圖譜構(gòu)建及共有特征峰四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜分析

湯丹，曹東敏，黃廣梟，羅家敏，郭寧，王淑美

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006； 3.廣東省中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006； 4.廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006； 5.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 東莞 523000)

葛根為豆科植物野葛Puerarlialobata(Wild.) Ohwi的干燥根，習(xí)稱“野葛”，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。葛根具有解肌退熱、生津止渴、透疹等功效，現(xiàn)代藥理研究表明它具有廣泛的藥理活性，特別是在心腦血管疾病、糖尿病等方面療效確切[1-3]。本課題前期采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對接等技術(shù)，研究了葛根干預(yù)2型糖尿病及缺血性腦卒中的潛在活性成分和作用機(jī)制，研究表明以葛根素、大豆苷等為代表的異黃酮類化合物是葛根中的主要活性成分[4-6]。

目前與葛根指紋圖譜相關(guān)研究已有一些文獻(xiàn)報道[7-9]，成功用于藥材質(zhì)量評價等領(lǐng)域，但是多數(shù)局限于色譜指紋圖譜的建立和比較，對其中共有峰的指認(rèn)鑒定關(guān)注較少，值得進(jìn)一步研究。四級桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜(Q-Orbitrap HRMS/MS)為新一代的高分辨質(zhì)譜，相對于其他高分辨質(zhì)譜，具有分辨率、質(zhì)量精度和靈敏度更高，質(zhì)量穩(wěn)定性更好等諸多優(yōu)勢。通過全掃描/數(shù)據(jù)依賴性二級掃描模式，一次進(jìn)樣分析即可高通量完成高精度的一級和二級質(zhì)譜掃描，得到精確質(zhì)量數(shù)和離子碎片等化合物鑒定所需的信息，特別適用于中藥等復(fù)雜體系中化學(xué)成分的定性定量分析[10-12]。本研究擬通過建立葛根的HPLC指紋圖譜，并采用HPLC-Q-Orbitrap HRMS/MS液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定共有峰成分，以期為葛根的質(zhì)量綜合評價提供可行方法，并為后續(xù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000 高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器，Q Exactive四級桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Secura125D型十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)；DK-S22型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012年版，國家藥典委員會)。

1.2 試藥

葛根素、葛根素芹糖苷、葛根素木糖苷、3′-甲氧基葛根素、3′-羥基葛根素、芒柄花素、大豆苷、大豆苷元(質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%)，均購自成都克洛瑪生物科技有限公司。乙腈、甲酸(色譜純，美國Fisher公司)；蒸餾水(屈臣氏集團(tuán)公司)；其余試劑均為分析純。

藥材購自各藥店或藥材公司，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥資源系馬鴻雁副教授鑒定為豆科植物野葛Puerarialobate(Wild.) Ohwi的干燥根，藥材來源信息詳見表1。

表110批葛根藥材的來源信息表

Table1The Sources of 10 Batches of Puerariae Lobatae Radix

序號批號產(chǎn)地購買公司S1HX18R01湖南桑植廣東和翔制藥S220180804湖南麻陽慈谷鑫馨藥房S3181001廣東蕉嶺林芝參藥業(yè)S4180704廣西玉林萬圣堂藥房S5181101廣東蕉嶺同仁堂藥業(yè)S6180902湖南麻陽美佳康大藥房S7180807廣東佛岡參芪大藥房S820180701湖南桑植仁和堂大藥房S9180904廣西平南恒金堂大藥房S1020180501廣東佛岡七樂康大藥房

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Inertsil ODS-3 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，11%A→12%A；5～30 min，12%A→14%A，30～45 min，14%A→30%A；45～55 min，30%A→60%A；55～60 min，60%A→100%A)，流速為0.8 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為25 ℃。

2.2 高分辨質(zhì)譜條件

離子源：可加熱式電噴霧離子源(HESI)；檢測方式：負(fù)離子模式；噴霧電壓：-3 000 V；輔助氣溫度：310 ℃；毛細(xì)管溫度：320 ℃；鞘氣流速：13.5 L/min；輔助氣流速：3 L/min。一級質(zhì)譜采用全掃描，范圍m/z120～800，質(zhì)量分辨率為70 000，二級質(zhì)譜采用動態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描，碰撞能梯度為30、40 eV。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取葛根素芹糖苷、葛根素木糖苷、3′-甲氧基葛根素、3′-羥基葛根素、芒柄花素、葛根素、大豆苷、大豆苷元對照品適量，用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度分別為147、127、118、137、127、209、161、195 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取葛根藥材粉末1 g (過3號篩)，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入30%(φ,下同)乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 空白溶劑考察 取甲醇，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果表明空白溶劑無干擾。

2.5.2 精密度考察 取同一批供試品溶液5 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以葛根素色譜峰的保留時間和色譜峰面積為參照，計(jì)算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD均≤0.08%、相對峰面積的RSD均≤4.97%，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性考察 取同一批供試品溶液(批號HX18R01)5 μL，分別于0、2 、4、8、12、24 h測定，記錄色譜圖，以葛根素色譜峰的保留時間和色譜峰面積為參照，計(jì)算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD均≤0.22%、相對峰面積的 RSD 均≤4.94%，表明24 h 內(nèi)樣品的穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性考察 取同一批次(批號HX18R01)葛根粉末(過3號篩)6份，每份1 g。分別按“2.4”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以葛根素色譜峰的保留時間和色譜峰峰面積為參照，計(jì)算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD值均≤0.14%，相對峰面積均≤5.0%，表明本法具有良好的重復(fù)性。

2.6 指紋圖譜的建立與技術(shù)參數(shù)的確定

2.6.1 指紋圖譜的建立 取10批葛根樣品(S1～S10)，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰，采用“中藥色譜指紋圖譜相似評價系統(tǒng)”(2012年版)對圖譜進(jìn)行分析，以樣品S1為參照圖譜，以中位數(shù)法生成的共有模式作為對照圖譜，時間窗寬度為0.1 s，得到10批樣品的圖譜均有12個共有峰，見圖1～圖2。以葛根素峰(4號)為參照峰，計(jì)算10批樣品共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果見表2～表3。

S1～S10.表1中S1～S10號樣品。

圖110批葛根藥材的HPLC指紋圖譜重疊圖

Figure1HPLC fingerprint for 10 batches of Puerariae Lobatae Radix

1.葛根素-4′-O-葡萄糖苷； 2. 3′-甲氧基葛根素-4′-O-葡萄糖苷； 3. 3′-羥基葛根素； 4.葛根素； 5.葛根素-6″-O-木糖苷； 6. 3′-甲氧基葛根素； 7.葛根素芹糖苷； 8.大豆苷； 9.染料木素-8-C-芹糖基(1→6)-葡萄糖苷； 10.大豆苷元； 11.芒柄花素； 12.異大豆苷元。

圖210批葛根藥材生成的對照指紋圖譜

Figure2HPLC common pattern fingerprint of 10 batches of Puerariae Lobatae Radix

表2 10批葛根藥材的相對保留時間Table 2 Relative retention time of common peaks for 10 batches of Puerariae Lobatae Radix

表3 10批葛根藥材的相對峰面積Table 3 Relative area of common peak for 10 batches of Puerariae Lobatae Radix

2.6.2 相似度評價 利用“中藥色譜指紋圖譜相似評價系統(tǒng)”(2012年版)(軟件相似度計(jì)算采用向量夾角余弦法，相似度結(jié)果在0.9～1.0之間為符合要求)，將上述10批葛根樣品與對照指紋圖匹配，進(jìn)行相似度評價，結(jié)果依次為0.998、0.994、0.993、0.995、0.997、0.999、0.970、0.998、0.996、0.993。各批葛根藥材與對照指紋圖譜間的相似度均不小于0.97，符合指紋圖譜的技術(shù)要求，表明10批次藥材之間具有較好的一致性，本方法可用于綜合評價葛根藥材的整體質(zhì)量。

2.6.3 指紋圖譜中主要共有峰的鑒定

葛根中的主要成分為異黃酮類成分[1]，采用已有對照品比對，可準(zhǔn)確鑒定出葛根指紋圖譜中的以下共有特征峰：3′-羥基葛根素(峰3)、葛根素(峰4)、葛根素-6″-O-木糖苷(峰5)、3′-甲氧基葛根素(峰6)、葛根素芹糖苷(峰7)、大豆苷(峰8)、大豆苷元(峰10)、芒柄花素(峰11)。異黃酮的裂解方式主要是通過斷裂糖苷鍵和C4位羰基中性丟失CO的C環(huán)裂解以及逆Diels-alder(RDA)裂解，通過分析C環(huán)RDA裂解產(chǎn)生的開環(huán)碎片和特征丟失的中性碎片，可以判斷異黃酮母核的官能團(tuán)取代情況[13]。從質(zhì)譜數(shù)據(jù)中可以較容易區(qū)分碳苷和氧苷，如葛根素和大豆苷分子量均為416，大豆苷為氧苷，在負(fù)離子模式質(zhì)譜中容易因氧糖苷鍵斷裂，脫去1個葡萄糖基(162 Da)，得到特征碎片離子峰m/z253[M-glc-H]-，與大豆苷元的準(zhǔn)分子離子峰一致；而葛根素為碳苷，結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵較穩(wěn)定不易斷裂，但有中性丟失特征碎片m/z295[M-C4H8O4-H]-，葛根素的衍生物3′-羥基葛根素和3′-甲氧基葛根素也都有該中性丟失特征裂解，分別產(chǎn)生碎片m/z311[M-C4H8O4-H]-和m/z325[M-C4H8O4-H]-。從異黃酮苷元的裂解規(guī)律來看，常見[M-CH2O-H]-和[M-CH2O-CO-H]-等特征碎片。

特征峰1(tR=9.16 min)，一級質(zhì)譜中出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z577.155 0[M-H]-，經(jīng)計(jì)算分子式為C27H30O14，在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)碳苷的特征碎片m/z457[M-C4H8O4-H]-，再發(fā)生葡萄糖氧苷鍵斷裂形成特征碎片m/z295[M-C4H8O4-glc-H]-，據(jù)此可推斷應(yīng)為葛根素的葡萄糖苷，結(jié)合文獻(xiàn)[14-15]推測特征峰1為葛根素-4′-O-葡萄糖苷。特征峰2(tR=12.76 min)，一級質(zhì)譜中出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z607.160 5[M-H]-，經(jīng)計(jì)算分子式為C28H32O15，在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)碳苷的特征碎片m/z487[M-C4H8O4-H]-，同時也有葡萄糖氧苷特征碎片m/z325[M-C4H8O4-glc-H]-，結(jié)合文獻(xiàn)[14-15]推測特征峰2為3′-甲氧基葛根素-4′-O-葡萄糖苷。特征峰9(tR=36.72 min)，一級質(zhì)譜中出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z563.139 1[M-H]-，經(jīng)計(jì)算分子式為C26H28O14，在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)芹菜糖氧苷鍵斷裂形成的特征碎片m/z431[M-apiose-H]-，以及碳苷的特征碎片m/z311[M-apiose-C4H8O4-H]-以及m/z283[M-apiose-C4H8O4-CO-H]-，結(jié)合文獻(xiàn)[14-15]推測特征峰9為染料木素-8-C-芹糖基(1→6)-葡萄糖苷。特征峰12(tR=47.92 min)，一級質(zhì)譜中出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z253.050 0[M-H]-，經(jīng)計(jì)算分子式為C15H10O4,其二級質(zhì)譜碎片也與大豆苷元一致，結(jié)合文獻(xiàn)[15]推測特征峰12為異大豆苷元。指紋圖譜中主要共有峰的鑒定結(jié)果見表4。

表4 葛根樣品中主要共有峰的高分辨液質(zhì)分析結(jié)果Table 4 HPLC-HRMS/MS analysis of main common peaks in Puerariae Lobatae Radix samples

*為化合物經(jīng)對照品比對。

3 討論

3.1 供試品溶液的制備

分別考察了水，30%、50%、70%甲醇，30%、50%、70%乙醇的提取效果，以色譜峰的個數(shù)為評價指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果表明，采用30%乙醇提取時色譜峰數(shù)目較多，因此最終選擇30%乙醇作為提取溶劑。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

因葛根藥材成分較復(fù)雜，故先后對乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸等不同溶劑系統(tǒng)的不同比例進(jìn)行了考察，結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸為流動相梯度洗脫時效果最佳，當(dāng)檢測波長為 254 nm時，各色譜峰分離度和峰型較好，色譜峰數(shù)目較多，分布均勻，基線平穩(wěn)。

3.3 共有特征峰的高分辨質(zhì)譜鑒定

四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜將四極桿離子選擇和 Orbitrap 靜電場軌道阱技術(shù)高分辨掃描結(jié)合，可采用全掃描和自動觸發(fā)二級掃描模式同時對正負(fù)離子進(jìn)行快速測定，能夠提供高質(zhì)量的全掃描和MS/MS數(shù)據(jù)，具有分辨率高、質(zhì)量精度高、靈敏度高、質(zhì)量軸穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)?fù)雜體系中多種微量組分進(jìn)行快速鑒定分析，是分析中藥復(fù)雜體系的有力工具。

本研究構(gòu)建了葛根藥材的HPLC指紋圖譜，通過其豐富的色譜峰信息和共有峰相似度分析，對10批不同產(chǎn)地的市售葛根藥材的質(zhì)量進(jìn)行了評價。同時采用新型HPLC-Q-Orbitrap HRMS/MS高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對指紋圖譜中的12個共有特征峰異黃酮成分進(jìn)行了鑒定歸屬，為評價葛根藥材的質(zhì)量提供了依據(jù)，并為后續(xù)葛根藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。