黃花敗醬總皂苷的HPLC-Q-TOF MS成分分析

陳淑玲，王曉玉，鐘艷梅，李衛(wèi)東，4，韓亮，4

(廣東藥科大學(xué) 1.中藥學(xué)院; 2.健康學(xué)院; 3.中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006； 4.廣東省光與健康工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510310)

黃花敗醬為敗醬科(Valerianaceae)敗醬屬(Patrinia)黃花敗醬(PatriniascabiosaefoliaFisch)的根或帶根全草，在我國(guó)分布廣泛[1]，味辛、性寒，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱利濕、解毒排膿、祛瘀止痛的功效[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃花敗醬具有抗菌[3]、抗病毒、抗感染、保肝利膽、抗腫瘤和抗氧化等作用[4-5]，臨床上常用于治療潰瘍性結(jié)腸炎、闌尾炎和慢性胃炎等[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃花敗醬醇提物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有顯著的改善和治療作用[7]；本課題組前期研究結(jié)果也顯示，黃花敗醬總皂苷提取物對(duì)三硝基苯磺酸致大鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有明顯的改善和治療作用，不僅能顯著降低炎癥結(jié)腸組織的TNF-α、IL-1β含量、MPO活性和MDA水平，而且能明顯升高SOD活性[8-9]；從黃花敗醬根部分離得到的皂苷類化合物能夠提高血清轉(zhuǎn)氨酶的活性，抑制肝炎病毒的活性，其苷元齊墩果酸更被認(rèn)為是抗肝炎的強(qiáng)活性成分[10]：因此，推測(cè)黃花敗醬皂苷類成分可能為其抗感染主要藥效活性成分。

目前，黃花敗醬的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確[11-12]，對(duì)黃花敗醬皂苷類成分的研究報(bào)道尚少，為了進(jìn)一步揭示黃花敗醬藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，開發(fā)其藥用價(jià)值，本研究采用高效快速、高靈敏度的HPLC-Q-TOF MS方法對(duì)黃花敗醬總皂苷部位的化學(xué)成分進(jìn)行了鑒別分析，為黃花敗醬的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

黃花敗醬(500 g)，購(gòu)自廣州至信藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為：170701，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院王鳳云老師鑒定為黃花敗醬(PatriniascabioscaefoliaFisch)的帶根全草。黃花敗醬總皂苷部位(由本課題組前期研究所得的最佳提取純化工藝所制得)。黃花敗醬皂苷C(Scabioside C)對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.49%，成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-17103006)；齊墩果酸對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≧98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：121213)；乙腈(色譜純，德國(guó)Merk公司)；甲酸(色譜級(jí)，德國(guó)Merk公司)；甲酸銨(色譜級(jí)，美國(guó)aladdin公司)。

HPLC-Q-TOF MS聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)，色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

稱量黃花敗醬總皂苷30 mg于2 mL EP管中，加70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇溶解并超聲10 min，12 000 r/min高速離心，取上清液，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取黃花敗醬C對(duì)照品0.1 mg，加70%甲醇水溶液1 mL，得對(duì)照品溶液。

2.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為ACQYITY UPLCTM BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為3 μL；流速為0.3 mL/min；波長(zhǎng)為330 nm；以0.1%甲酸-10 mmol/甲酸銨為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～4 min，98%～85%A；4～9 min，85%～80%A；9～11 min，80%～78%A；11～15 min，78%～50%A；15～18 min，50%～30%A；18～22 min，30%～10%A；22～25 min，10%～0%A；25～30 min，100%B)。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子采集模式，毛細(xì)管電壓為3 500 V，錐孔電壓為35 V，干燥氣流速為8 L/min，干燥氣溫度為320 ℃，掃描范圍(m/z)為100～1 500，MS/MS二級(jí)掃描碰撞能為20 V。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Qualitative Analysis B.0 7.00軟件分析各化學(xué)成分的保留時(shí)間及其質(zhì)譜信息，并結(jié)合分子離子峰與對(duì)照品、文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，再通過與Scifinder、Massbank和Chemspider等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行峰匹配檢索，對(duì)其中的化學(xué)成分進(jìn)行有效辨別。

3 結(jié)果

對(duì)黃花敗醬總皂苷部位進(jìn)行了正離子一級(jí)全掃描(50～1 500)及二級(jí)質(zhì)譜掃描，色譜掃描檢測(cè)時(shí)間為30 min，色譜峰分離較好，如圖1所示。對(duì)其中的27個(gè)峰進(jìn)行了分析鑒定，結(jié)果見表1。

本研究對(duì)27個(gè)色譜峰進(jìn)行了識(shí)別鑒定，主要通過分析各色譜峰的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖，獲取各個(gè)成分的高分辨質(zhì)譜分子量及分子式信息，通過Science finder、Massbank、Chemspder等數(shù)據(jù)庫的檢索并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)的比對(duì)，最終鑒定了以下化學(xué)成分(見表1)。以下以峰24為例說明分析過程。

數(shù)據(jù)處理采用Qualitative Analysis B.07.00分析軟件，從圖2可見，峰24的分子離子峰為m/z767.439 9[M+H]+，由高分辨質(zhì)譜給出其元素組成(預(yù)測(cè)分子式)為C41H66O13。從圖3可看到，在二級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)了m/z605、587、456、455及437等特征碎片離子，推測(cè)m/z605 [M+H-glc]+由[M+H]+脫去一分子葡萄糖形成，m/z587[M+H-glc-H2O]+由[M+H]+脫去一分子葡萄糖和水形成，m/z456[M+H-glc-ara]+由[M+H]+脫去一分子葡萄糖和一分子阿拉伯糖形成，m/z455由m/z456 [M+H-glc-ara]+脫去一個(gè)H形成，m/z437在m/z455基礎(chǔ)上再脫去一個(gè)H2O形成，推測(cè)峰24化合物可能的裂解途徑如圖4所示。通過查找Science finder、Massbank、Chemspder等數(shù)據(jù)庫檢索以及文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)品信息對(duì)比，峰24分子量、分子式及其質(zhì)譜裂解行為與文獻(xiàn)[13]報(bào)道和標(biāo)準(zhǔn)品黃花敗醬皂苷C一致，故推斷峰24所對(duì)應(yīng)的化合物為黃花敗醬皂苷C。

圖1 黃花敗醬總皂苷部位在正離子模式下的總離子流圖Figure 1 Total ion current diagram of the total sapo-nins of Patrinia scabiosaefolia Fisch in posi-tive ion mode

圖2 峰24的ESI-MS圖譜Figure 2 The ESI-MS spectrum of peak 24

圖3 峰24的ESI-MS/MS圖譜Figure 3 The ESI-MS/MS spectrum of peak 24

注：glc代表葡萄糖，ara代表阿拉伯糖。

圖4黃花敗醬皂苷C(峰24)可能的裂解途徑

Figure4Possible cleavage pathway of Scabioside C (peak 24) (Note:glc stands for glucose and ara stands for arabinose)

同理，通過與數(shù)據(jù)庫、對(duì)照品和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較，識(shí)別鑒定出了其余26個(gè)峰，初步鑒定出了每個(gè)峰所對(duì)應(yīng)的化合物，其中三萜皂苷類成分10種[14]，甾體皂苷2種，甾醇類3種，單萜類4種，有機(jī)酸類2種，糖苷類2種，黃酮類1種，其他類3種，其中4個(gè)化合物(蕓苔甾醇-D-葡萄糖苷、孕烷，β-D-核糖-己吡喃糖苷衍生物，Astraeusin C、孕烷，β-D-吡喃葡萄糖醛酸衍生物)為黃花敗醬成分分析的首次報(bào)道，化合物鑒定結(jié)果見表1。

表1 黃花敗醬總皂苷的化學(xué)成分分析Table 1 Chemical composition analysis of total saponins of Patrinia scabiosaefolia Fisch

4 討論

本研究所使用的黃花敗醬總皂苷部位由本課題組前期研究所優(yōu)化過的總皂苷提取純化工藝所制得，故所含的皂苷類含量較高，適用于本研究的分析。本研究采用HPLC-Q-TOF MS聯(lián)用技術(shù)，快速、全面地識(shí)別了黃花敗醬總皂苷部位中的主要化學(xué)成分。釆用正離子模式進(jìn)行全掃描檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)總皂苷純化部位成分在正離子模式下峰信息量大，質(zhì)譜響應(yīng)較強(qiáng)，可能與其中的皂苷類含量較高有關(guān)。通過高分辨質(zhì)譜信息，共分離和初步鑒定出了黃花敗醬大孔樹脂純化部位中的27種化合物：三萜皂苷類成分10種，甾體皂苷2種，甾醇類3種，單萜類4種，有機(jī)酸類2種，糖苷類2種，黃酮類1種，其他類3種，當(dāng)中的4個(gè)化合物(蕓苔甾醇-D-葡萄糖苷、孕烷，β-D-核糖-己吡喃糖苷衍生物，Astraeusin C、孕烷，β-D-吡喃葡萄糖醛酸衍生物)為黃花敗醬成分分析的首次報(bào)道。目前，關(guān)于黃花敗醬藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的報(bào)道不多，本研究也為黃花敗醬的定性分析及進(jìn)一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制提供有力的理論支撐和可借鑒的方法。