Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化有機(jī)硅季銨鹽包合物的制備工藝

帥方舟，陳靖文，林華慶

(廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院/廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

在眾多類型的抗菌劑中，有機(jī)硅季銨鹽{二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨，SQ5700}是一種綜合性能比較理想的抗菌劑濃縮液，可與任何比例的水、醇類、酮類、酯類烴類和氯化烴類相混溶，保存于甲醇溶劑中。該抗菌劑也是一類新型的陽離子表面活性劑，它對(duì)人體皮膚無刺激、無致癌作用，各項(xiàng)指標(biāo)符合國內(nèi)外對(duì)抗菌劑的要求[1]。甲醇有一定的毒性，長期使用對(duì)人體有一定的損害，而且甲醇易燃，其運(yùn)輸成本和危險(xiǎn)性都很高。如果把有機(jī)硅季銨鹽以水作為溶劑保存，不但可以降低對(duì)人體的危害，而且還可以降低成本。但是，有機(jī)硅季銨鹽在水中會(huì)被水解，因其分子中含有三甲氧基硅基，在水中水解為硅羥基，容易縮聚為不溶于水的網(wǎng)狀聚硅氧烷，在4～8 h內(nèi)就會(huì)失去活性，故只能保存于有機(jī)溶劑中。本研究旨在尋找一種有效的方法，使得有機(jī)硅季銨鹽可以在水中保持穩(wěn)定[1-5]。

環(huán)糊精(β-CD)包合可以有效提高藥物穩(wěn)定性，在藥品領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)是經(jīng)過修飾的β-CD，通過對(duì)β-CD的羥丙基化，破壞分子內(nèi)氫鍵，顯著提高了水溶性，具有局部刺激性、不良反應(yīng)輕微等諸多優(yōu)點(diǎn)[6-7]。

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法是響應(yīng)面設(shè)計(jì)法的一種，它可以提供3到10個(gè)因素，高、中、低三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析，可以考察各個(gè)因素對(duì)效應(yīng)(包封率)的影響以及各因素間的交互作用，也能進(jìn)行各個(gè)因素的最優(yōu)化。該方法使用方便，比單因素考察更全面客觀，而且預(yù)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此被廣泛地用于藥學(xué)研究中[8-10]。本研究采用溶液-攪拌法制備了有機(jī)硅季銨鹽-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物(SQ5700-HP-β-CD包合物)，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響包合物制備的因素進(jìn)行優(yōu)化考察，篩選出最佳的制備工藝。

1 儀器與材料

ZK-82A真空干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)；C-MAG HS 4磁力攪拌器(德國艾卡 RCT basic)；DSC4000差示掃描量熱儀(美國珀金埃爾默儀器有限公司)；Spectrum100傅里葉變換紅外光譜儀(美國珀金埃爾默儀器有限公司)；BS224S萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；有機(jī)硅季銨鹽(SQ5700，湖南利潔生物集團(tuán)股份有限公司)；羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD，淄博千匯生物有限公司)；丙酮(天津大茂化學(xué)試劑廠)；去離子水(廣州亞飛水處理設(shè)備有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 SQ-5700-HP-β-CD包合物的制備

為避免在制備包合物的過程中SQ5700與水接觸導(dǎo)致水解失活，選擇無水乙醇作為溶劑溶解SQ5700；在制備方法上，由于乙醇的冰點(diǎn)為-117.3 ℃，冷凍干燥法中凍干機(jī)無法使無水乙醇到達(dá)冰點(diǎn)升華，選用溶液-攪拌法制備包合物[11]：精密稱取一定量的HP-β-CD于燒杯中，用無水乙醇配制成飽和溶液，攪拌并溶解。在一定溫度、一定轉(zhuǎn)速下，加入一定量的SQ5700，攪拌一定時(shí)間后，真空干燥，得SQ5700-HP-β-CD包合物粗品，丙酮洗滌，真空干燥揮去丙酮，既得SQ5700-HP-β-CD包合物。

2.2 SQ5700質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

2.2.1 0.004 mol/L十二烷基硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取十二烷基硫酸鈉0.288 5 g(精確至0.000 1 g)，置于250 mL容量瓶中，加入去離子水至刻度定容，搖勻，備用。

2.2.2 混合指示劑的配制 精密稱取溴化乙啶(0.5±0.005)g，置于50 mL燒杯內(nèi)，再精密稱取酸性藍(lán)(0.25±0.005)g置于另一個(gè)50 mL燒杯中，用體積分?jǐn)?shù)10%乙醇20～30 mL于40 ℃左右攪拌使溶解。精密移取2種溶液至同一個(gè)250 mL容量瓶內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)10%乙醇沖洗燒杯，洗液并入容量瓶，加入去離子水至容量瓶刻度線定容，搖勻后即得儲(chǔ)備液，備用。精密移取20 mL儲(chǔ)備液于500 mL容量瓶中，加適量蒸餾水，再精密移取245 g/L H2SO4溶液20 mL，用去離子水定容至刻度，搖勻，避光貯存。

2.2.3 SQ-5700質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 根據(jù)文獻(xiàn)[12]以及中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GBT 5174-2004《表面活性劑洗滌劑陽離子活性物含量的測定》，選用溴化乙啶-酸性藍(lán)滴定法測定SQ-5700的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：常溫下，精密稱取SQ5700-HP-β-CD包合物10 g，置于100 mL容量瓶中，加入適量去離子水超聲15 min進(jìn)行溶解，冷卻至室溫，繼續(xù)加入去離子水稀釋至容量瓶刻度線。精密移取樣品溶液5 mL至100 mL具塞量筒中。分別加蒸餾水2 mL，三氯甲烷3 mL，混合指示劑溶液2 mL，混合均勻。用十二烷基硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加后加塞劇烈振動(dòng)，然后靜置分離，當(dāng)接近終點(diǎn)時(shí)，搖動(dòng)而形成的乳濁液極易破乳，繼續(xù)逐滴滴定并反復(fù)猛烈搖動(dòng)，直至藍(lán)色褪去，三氯甲烷層為淺灰-粉紅色即達(dá)終點(diǎn)。準(zhǔn)確記錄滴加標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，按以下公式計(jì)算SQ-5700的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

式中：X為SQ-5700的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；V為滴定消耗的十二烷基硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C為十二烷基硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；M為有機(jī)硅季銨鹽的分子量，M=496.28；m為稱取樣品的質(zhì)量，g。

2.2.4 專屬性考察 根據(jù)文獻(xiàn)[9]，按“2.1”項(xiàng)方法在相同條件下制備6組等量且不含SQ5700的包合物，用“2.2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行測定，6組滴定試驗(yàn)均為陰性。另制備6組含有SQ5700的包合物，但不經(jīng)過丙酮洗滌，對(duì)比未經(jīng)包合的相同質(zhì)量的SQ5700，結(jié)果測得包合物中SQ5700的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)與未經(jīng)包合的SQ5700的相差小于0.2%，說明HP-β-CD對(duì)測量結(jié)果無影響，即可對(duì)SQ-5700-HP-β-CD包合物以同樣方法測定SQ5700的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一批SQ5700原料藥2 g，6份，分別用“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，結(jié)果測得消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液的RSD數(shù)值為0.45%，小于2%，說明方法精密度良好。

2.3 包封率的測定

包封率按公式“包封率=m/M×100%”計(jì)算，其中m為包合物中SQ5700的質(zhì)量，M為總投入的SQ5700的質(zhì)量。

2.4 包合物的工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素考察 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，并在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在考察最佳包合工藝時(shí)，選取包合溫度、攪拌時(shí)間、壁芯比(HP-β-CD∶SQ-5700，質(zhì)量比，下同)和轉(zhuǎn)速為主要影響因素，并以包封率為指標(biāo)進(jìn)行單因素考察。

2.4.1.1 壁芯比對(duì)包合效果的影響 固定包合溫度為40 ℃，攪拌時(shí)間為40 min，轉(zhuǎn)速為500 r/min，以包合率為指標(biāo)，考察壁芯比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1時(shí)的包合效果。結(jié)果顯示，壁芯比由1∶1升高到2∶1時(shí)，包封率從82.36%增加至89.82%，但隨著壁芯比的進(jìn)一步升高，包封率有所下降并逐漸趨于穩(wěn)定，最后選用壁芯比為1∶1、2∶1、3∶1。

2.4.1.2 包合溫度對(duì)包合效果的影響 固定攪拌時(shí)間為40 min，壁芯比為2∶1，轉(zhuǎn)速為500 r/min，以包合率為指標(biāo)，考察包合溫度分別為30、35、40、45、50 ℃時(shí)的包合效果。結(jié)果顯示，包合溫度由30 ℃升高到40 ℃時(shí)，包封率從81.44%增高到90.04%，但隨著溫度的升高，包封率有所下降并逐漸趨于穩(wěn)定，最后選用包合溫度為35、40、45 ℃。

2.4.1.3 攪拌時(shí)間對(duì)包合效果的影響 固定包合溫度為40 ℃，壁芯比為2∶1，轉(zhuǎn)速為500 r/min，以包合率為指標(biāo)，考察攪拌時(shí)間分別為20、40、60、80、100 min時(shí)的包合效果。結(jié)果顯示，攪拌時(shí)間由20 min到40 min時(shí)，包封率從78.42%增高到89.94%，但從40 min之后包封率開始下降并趨于穩(wěn)定，最后選用包合時(shí)間為20、40、60 min。

2.4.1.4 轉(zhuǎn)速對(duì)包合效果的影響 固定包合溫度為40 ℃，攪拌時(shí)間為40 min，壁芯比為2∶1，以包合率為指標(biāo)，考察轉(zhuǎn)速分別為100、300、500、700、900 r/min時(shí)的包合效果。結(jié)果顯示，包合物的包封率無明顯變化。

2.4.2 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化包合物制備工藝

2.4.2.1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 根據(jù)單因素考察的基礎(chǔ)，選擇壁芯比、攪拌時(shí)間、反應(yīng)溫度作為考察對(duì)象，以包封率(Y)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平響應(yīng)面法優(yōu)化SQ5700-HP-β-CD包合物的包合條件，采用Design expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，共17組實(shí)驗(yàn)，包括5組中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，求取最優(yōu)的提取工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Box-Behnken design and results

2.4.2.2 模型擬合 根據(jù)包合物包封率指標(biāo)對(duì)影響因素進(jìn)行二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型擬合結(jié)果：Y=-18.82+2.706 5A+0.680 8B+4.552 2C+0.198 8AB+0.079 5AC+0.012 9BC-1.402 3A2-0.000 294 31B2-0.051 7C2。由表2的方差分析可知，該數(shù)學(xué)模型P值小于0.000 1，說明該模型極其顯著。失擬項(xiàng)P值大于0.05，表明不顯著，即該數(shù)學(xué)模型在被分析的整個(gè)回歸趨于內(nèi)擬合較好。該方程的多元相關(guān)系數(shù)R2為0.987 1，進(jìn)一步說明模型有較好的擬合度。因素A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2為顯著影響因素，說明對(duì)包合物包封率影響較大。因此，回歸方程可以較好地描述各個(gè)因素與響應(yīng)值(包封率)之間的關(guān)系，可以利用該回歸方程找出HP-β-CD包合SQ5700的最優(yōu)條件。

2.4.2.3 影響因素的響應(yīng)面曲線圖 根據(jù)Box-Behnken軟件繪制不同影響因素對(duì)于響應(yīng)值的三維曲圖：分別固定3個(gè)影響因素其中之一，考察其他2個(gè)因素對(duì)包合物包封率影響的響應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖1。圖1A顯示，當(dāng)壁芯比較低時(shí)，包封率隨包合溫度的升高而增大，但隨壁芯比的增加，包封率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。同理，在包合溫度較低時(shí)，包封率隨壁芯比的增大而增大，但到達(dá)一定溫度后，包封率又開始下降。圖1B顯示從包合開始，包封率隨壁芯比增加而變大，但時(shí)間到達(dá)一定值后，包封率開始下降。原因可能是在壁芯比量較高時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)受阻，阻礙了包合過程的進(jìn)行。圖1C顯示不同包合溫度下，包封率隨時(shí)間的延長呈先增大后減小的趨勢(shì)；不同的攪拌時(shí)間的情況下，隨包合溫度的升高，包封率也是同樣的出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。

表2 方差分析結(jié)果Table 2 The Analysis of variance

2.4.2.4 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，并結(jié)合包合物的制備工藝，得到優(yōu)化條件為：壁芯比2.38∶1，攪拌時(shí)間31.22 min，包合溫度41.94 ℃。為了方便實(shí)驗(yàn)，把參數(shù)調(diào)整為壁芯比2.4∶1，攪拌時(shí)間31 min，包合溫度42 ℃。按照優(yōu)化后的工藝參數(shù)，制備3批樣品分別測定其包封率，結(jié)果得理論包封率為90.49%，實(shí)測包封率為93.66%，實(shí)測值與理論計(jì)算值偏差小于5%，模型選用合理有效。

2.5 包合物的檢測

2.5.1 差示掃描量熱法

分別稱量HP-β-CD、SQ5700與HP-β-CD物理混合物和SQ5700-HP-β-CD包合物樣品4.00～7.00 mg，置坩堝中進(jìn)行壓片密封，分別進(jìn)行測定，測定條件為：N2流速30 mL/min，以10 ℃/min的升溫速率在30～300 ℃條件下測定樣品的熱性質(zhì)[13-15]，結(jié)果見圖2。

A.壁芯比和包合溫度對(duì)包封率的影響； B.壁芯比和攪拌時(shí)間對(duì)包封率的影響； C.攪拌時(shí)間和包合溫度對(duì)包封率的影響。

圖1各因素交互作用的響應(yīng)面圖
Figure1Responsive Surface and contours of the interaction of each factors

圖2HP-β-CD、SQ5700、SQ5700與HP-β-CD物理混合物及SQ5700-HP-β-CD包合物的DSC圖譜

Figure2DSC spectra of HP-β-CD,SQ5700,HP-β-CD/SQ5700 mixture and HP-β-CD/SQ5700 inclusion complex

可見，SQ5700在210 ℃左右有吸熱峰；而HP-β-CD屬于無定型粉末，在50～110 ℃有吸熱峰，可能是由于HP-β-CD脫水引起的，而HP-β-CD物理混合物的圖譜，出現(xiàn)了HP-β-CD與SQ5700吸熱峰的簡單疊加，在250～300 ℃間出現(xiàn)了多個(gè)峰，可能是因?yàn)槲锢砘旌衔镏写嬖谥鴥烧咧g的物理相互作用的影響，說明物理混合物并不起包合作用。SQ5700-HP-β-CD包合物的圖譜表明在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi)沒有任何尖銳峰出現(xiàn)，所有的吸熱峰消失，證實(shí)了包合物的形成。

2.5.2 紅外光譜法

分別稱量HP-β-CD、SQ-5700與HP-β-CD物理混合物和SQ5700-HP-β-CD包合物樣品適量，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描，用KBr壓片繪制紅外光譜圖[16-17]，結(jié)果見圖3。

可見，SQ5700在779 cm-1附近有Si-O-C鍵的彎曲振動(dòng)，在1 115 cm-1附近處有Si-O鍵的伸縮振動(dòng)峰，在2 921、2 851 cm-1處為CH3和CH2的伸縮振動(dòng)峰等，HP-β-CD的紅外光譜都顯示糖類的特征吸收峰，1 652 cm-1附近為O-H彎曲振動(dòng)峰，2 926 cm-1為C-H 伸縮振動(dòng)，708 cm-1為O-H彎曲振動(dòng)等，949、854、757 cm-1左右存在葡萄糖環(huán)的特征吸收。SQ5700-HP-β-CD物理混合物的紅外光譜可以視為二者紅外的物理疊加。包合物的紅外圖譜與HP-β-CD類似，SQ-5700的1 115、2 921、2 851 cm-1吸收峰減弱，HP-β-CD的1 652 cm-1位置的吸收峰消失，因?yàn)镾Q5700借助氫鍵等次級(jí)鍵作用包入HP-β-CD空腔中，受其約束，SQ5700相關(guān)基團(tuán)振動(dòng)消失、減弱，這也從間接驗(yàn)證了包合物的形成。

圖3SQ5700(A)、HP-β-CD(B)、SQ5700與HP-β-CD物理混合物(C)及SQ5700-HP-β-CD包合物(D)的紅外圖譜

Figure3FTIR of SQ5700(A),HP-β-CD(B),HP-β-CD/SQ5700 mixture(C) and SQ5700-HP-β-CD inclusion complex(D)

2.6 包合物的水溶液穩(wěn)定性考察

精密稱取SQ5700-HP-β-CD包合物10 g，置于100 mL容量瓶中，加入去離子水適量進(jìn)行超聲溶解，超聲30 min后，取出冷卻至室溫，繼續(xù)加入去離子水稀釋至刻度線進(jìn)行定容。分別于1、4、7 d按“2.2”項(xiàng)方法測定其中SQ5700質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，重復(fù)測定3次，取平均值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1 d到第7 d，SQ5700平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降了0.39%，表明通過HP-β-CD的包合可提高SQ5700在水中的穩(wěn)定性。

3 討論

SQ5700可與任何比例的水、醇類、酮類、酯類烴類和氯化烴類相混溶，但它在水中容易被水解。本研究曾考察了SQ5700在水、無水乙醇、丙酮的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，在室溫放置第7 d后，SQ5700的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降了5.40%、0.26%、0.43%，表明SQ5700在水中不穩(wěn)定，而在無水乙醇和丙酮中穩(wěn)定性良好；另外，SQ-5700可以與丙酮以任意比例互溶，制備的包合物對(duì)丙酮的溶解度小，丙酮可以洗脫游離未包封的SQ-5700。因此，本研究采用無水乙醇作為溶劑、丙酮作為洗滌溶劑制備包合物。

HP-β-CD具有內(nèi)疏水外親水的性質(zhì)，本研究中SQ5700為親水性藥物，但其結(jié)構(gòu)中含有長鏈的烴基這類疏水基團(tuán)，可通過包合手段進(jìn)入到環(huán)糊精的內(nèi)部，又因?yàn)槠浠瘜W(xué)結(jié)構(gòu)的[R-Si-(OCH3)3]三甲氧基硅具有硅烷的特性，甲氧基(—OCH3)易發(fā)生脫甲醇反應(yīng)(CH3OH)，而形成硅醇基[R-Si-(OH)3]，其多個(gè)羥基可與HP-β-CD空穴開口處的羥基形成分子間氫鍵，使SQ5700和HP-β-CD復(fù)合在一起，形成包合物，因此 DSC和紅外光譜在包合物中檢測不到SQ5700的特征峰。

本研究通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化SQ5700-HP-β-CD包合物的制備工藝，結(jié)果表明，經(jīng)過工藝參數(shù)優(yōu)化后，理論預(yù)測的包合物包封率與實(shí)測值偏差在5%以內(nèi)，證明其相關(guān)性良好。

對(duì)載藥包合物穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，原料藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降5.4%，而包合物的下降0.5%以內(nèi)，證明包合物可以顯著提高藥物穩(wěn)定性。包合物的鑒別方法可以采用多種方法，本文采用DSC法和FTIR法鑒別包合物的形成，對(duì)于包合物的理化性質(zhì)將在后續(xù)的工作中進(jìn)行進(jìn)一步的研究。