擬南芥CKI1基因上游轉錄調控因子篩選及鑒定

劉振寧，袁黎，Venkatesan Sundaresan，余小林

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擬南芥基因上游轉錄調控因子篩選及鑒定

劉振寧1,2,3，袁黎2,4，Venkatesan Sundaresan2，余小林3

1. 臨沂大學農林科學學院，臨沂 276000 2. 加州大學戴維斯分校植物科學系，加利福尼亞州戴維斯 95616，美國 3. 浙江大學農業(yè)與生物技術學院，杭州 310058 4. 西北農林科技大學園藝學院，楊凌 712100

擬南芥CKI1 (cytokinin independent 1)是雙組分信號系統(tǒng)中一個組氨酸激酶蛋白，通過作用于下游組氨酸磷酸轉移蛋白激活雙組分信號通路，在調控胚囊中央細胞命運分化和發(fā)育過程中具有重要作用。然而目前對于基因上游轉錄調控因子還知之甚少。本研究分析了不同長度的啟動子在擬南芥胚囊中的活性，并利用酵母單雜交技術對上游轉錄調控因子進行了篩選和鑒定。結果表明，位于內含子區(qū)域中的片段表現(xiàn)出與啟動子全長相一致的表達活性。進一步選取3個串聯(lián)重復的片段用于構建誘餌表達載體，同時，選取擬南芥雌蕊構建cDNA文庫，通過酵母單雜交篩選獲得226個陽性克隆。去除低質量及冗余重復的序列后共獲得66條可讀序列，其中8條序列對應的基因編碼具有DNA結合功能的蛋白。研究結果為進一步揭示基因的轉錄調控機制提供了重要參考信息。

；轉錄調控；酵母單雜交；擬南芥

雙組分信號系統(tǒng)(two-component system, TCS)最初是在研究大腸桿菌()氮調節(jié)蛋白系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)的[1]。最簡單的雙組分信號系統(tǒng)包括用于感應輸入信號的組氨酸激酶(histidine kinase, HK)和用于調節(jié)輸出信號的反應調節(jié)因子(response regulator, RR)兩種元件，原核生物常以簡單的雙組分信號系統(tǒng)形式存在。在細菌、酵母、粘液菌和植物中，雙組分信號系統(tǒng)進化為包括組氨酸激酶(histidine kinase, HK)、組氨酸磷酸轉移蛋白(histidine phospho-transfer, HP)和反應調節(jié)因子(response regulator, RR)的多步磷酸化傳遞的雙組分信號系統(tǒng)。

CKI1(AT2G47430)是第一個被發(fā)現(xiàn)的具有細胞分裂素受體特征的組氨酸激酶蛋白，在不添加細胞分裂素的培養(yǎng)基上，的過量表達能夠導致特異的細胞分裂素應答反應[2,3]。CKI1蛋白主要定位于內質網(wǎng)和細胞質膜上[3~5]。Deng等[6]采用qRT-PCR方法研究了基因的表達模式，發(fā)現(xiàn)主要在擬南芥()的開放花、角果和花蕾中表達。Hejatko等[7]利用原位雜交技術和啟動子GUS融合蛋白分析表明，在胚囊發(fā)育的FG1 (female gametophyte 1)時期到成熟胚囊期FG7時期均穩(wěn)定表達，尤其在成熟胚囊期的中央細胞中表達量比較高，在卵細胞和助細胞中的表達量比較低。另外，在擬南芥花序的維管組織中也有明顯的表達信號[8]。功能缺失突變體()植株的營養(yǎng)生長階段沒有明顯的表型，但雌配子體表現(xiàn)為50%敗育的表型。遺傳學實驗證據(jù)表明，功能缺失的突變體其T-DNA插入位點不能通過母本傳遞到子代中，因而也無法獲得純合的功能缺失突變體。對突變體胚囊的細胞學觀察表明，突變體胚囊的敗育發(fā)生在FG4時期向FG5時期的轉換期[4,6,7,9]。水稻()中同源基因()的功能缺失突變體也表現(xiàn)出雌配子體敗育表型[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CKI1通過作用于下游AHP2、AHP3和AHP5調控中央細胞的命運分化[5,11,12]，但是目前仍不清楚該基因的轉錄調控機制。Dobisova等[13]對轉基因株系進行EMS誘變，對上游轉錄調控因子進行篩選，發(fā)現(xiàn)基因的表達受到光敏色素蛋白的調控，并且啟動子區(qū)域存在大量G-box和GATA motif等光周期響應元件，進一步通過酵母單雜交實驗也證明PIF3和CCA1等受光敏色素蛋白調控的轉錄因子能夠與啟動子區(qū)域互作。但是篩選到的光敏色素蛋白相關轉錄因子的突變體并沒有表現(xiàn)出突變體的表型，由此推測，在胚囊發(fā)育 的階段還存在其他轉錄調控因子能夠調控的表達。

酵母單雜交是根據(jù)在細胞內DNA結合蛋白與DNA順式作用元件結合調控報告基因表達的原理，用來鑒定調控基因轉錄的上游轉錄因子基因的一種有效方法[14]。隨著酵母單雜交系統(tǒng)的不斷發(fā)展和完善，該方法近年來已被廣泛用于克隆和鑒定各種動植物的轉錄因子。本研究利用酵母單雜交技術對上游轉錄調控因子進行了篩選和鑒定，為進一步揭示基因的轉錄調控機制提供了新的數(shù)據(jù)及重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥Col-0野生型為本實驗室保存。擬南芥種子先用含20% Bleach和0.1% Tween 20的消毒液進行表面消毒10 min，然后使用滅菌的雙蒸水清洗3~5遍，置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待幼苗兩周大的時候，將幼苗轉移到帶有培養(yǎng)基質(草炭∶蛭石∶珍珠巖為6∶3∶2)的穴盤中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件保持16 h光照/8 h黑暗周期，溫度為22℃，相對濕度為60%。

1.2 不同片段長度CKI1啟動子載體的構建

因為酵母基因組比植物基因組小得多，酵母啟動子一般都比較短，如果整合到酵母基因組中的外 源啟動子太長，可能會影響目的蛋白和啟動子中順式作用元件結合的效率，而且會造成更多的假陽性[15,16]。因此，酵母單雜交一般選用幾到幾十bp的特定順式作用元件或者盡可能短的有啟動活性序列來構建誘餌表達載體。首先將基因啟動子平均分成若干區(qū)段，分別設計引物序列進行擴增，引物序列見表1。然后通過Ⅰ和Ⅰ雙酶切克隆到-CAMBIA1300中間載體中，構建帶有相應啟動子片段的--CAMBIA1300表達載體(圖1)。

1.3 轉基因株系的篩選和觀察

經過測序驗證后，構建成功的表達載體通過電轉化法轉入農桿菌AGL1菌株中，并通過浸花轉化法轉入到擬南芥野生植株中[17,18]。待轉化的擬南芥植株種子成熟，收集和干燥種子，然后通過上述擬南芥種子表面消毒和播種方法，將種子在含有25 mg/L潮霉素B的MS培養(yǎng)基中進行篩選，最后將篩選獲得的幼苗轉移到培養(yǎng)基質中正常培養(yǎng)。

表1 本研究使用的引物信息

下劃線序列表示引物中相應的酶切位點。

圖1 不同長度的CKI1基因啟動子活性分析載體構建示意圖

啟動子區(qū)域包括4段5′UTR(粉色區(qū)域)、3段內含子(藍色區(qū)域)和5′UTR上游序列(紫色區(qū)域)。F、F1、F2、F3、F4、F5和R1、R2、R3分別為上、下游引物。

對擬南芥胚囊中熒光信號進行觀察。首先在載玻片上滴幾滴滅菌的雙蒸水，然后在解剖鏡下將選取的雌蕊在雙蒸水中使用解剖針解剖開，僅留下胚珠，去除多余的組織，蓋上蓋玻片，立即在熒光顯微鏡(Zeiss, Axioskop 2 plus)下觀察拍照。

1.4 誘餌表達載體的構建與酵母遺傳轉化

誘餌表達載體的構建和酵母遺傳轉化參照酵母單雜交試劑盒(Clontech公司，美國)進行。為提高轉錄因子和順式作用元件的識別率和結合率，在誘餌表達載體構建中，本研究使用3個串聯(lián)重復的片段。首先，使用Ⅰ和Ⅰ雙酶切將第1個片段克隆到AbAi載體中，然后使用Ⅰ和Ⅰ雙酶切將第2個片段克隆到AbAi載體中，最后使用Ⅰ單酶切將第3個片段克隆到AbAi載體中，完成Bait-AbAi載體的構建。每一步載體構建均經過了酶切和測序驗證。然后將誘餌表達載體用BⅠ限制性內切酶切成線性質粒，轉入YIH酵母菌株感受態(tài)中。最后選取5個單菌落，使用Matchmarker Insert Check PCR Mix 1試劑盒(Clontech公司，美國)進行菌落PCR鑒定含有誘餌表達載體的陽性菌落，選取陽性菌落備用。

1.5 抑制誘餌菌株生長的最低AbA濃度的篩選

選取陽性菌落活化，然后用適量的0.9%NaCl重懸菌液，調制600值約為0.002。分別在含0 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL、250 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL、500 ng/mL、600 ng/mL、800 ng/mL和1000 ng/mL等不同濃度AbA的SD/-Ura固體培養(yǎng)基涂布100 μL菌液，置于30℃培養(yǎng)2~3 d，觀察酵母菌落的生長情況。

1.6 酵母單雜交文庫的構建與篩選

Smyth等[19]根據(jù)擬南芥花發(fā)育不同階段的形態(tài)特征將其劃分為12個時期。本研究選取擬南芥花發(fā)育階段在10~12時期的雌蕊提取RNA，然后將所提取的RNA按照Clontech公司單雜交文庫試劑盒的操作步驟進行反轉錄，合成含有SMARTⅢ和CDSⅢ錨定末端的雙鏈DNA (double strand cDNA, dscDNA)。RNA提取參照Invitrogen公司RNA提取試劑TRIzol產品操作說明書進行，RNA純化參照QIAGEN公司RNA純化試劑盒操作說明書進行。第一、第二鏈cDNA的合成、dscDNA的純化參照Clontech公司酵母單雜交試劑盒進行。

首先將制備好的3 μg dscDNA、6 μLGADT7- Rec載體(經Ⅰ線性化處理)和20 μL鮭魚精子DNA (10 mg/mL)轉入酵母感受態(tài)中，轉化液涂布在150 mm直徑含250 ng/mL濃度AbA的SD/-Leu固體培養(yǎng)基平板上，每個板涂布大約150 μL，同時將100 μL稀釋100倍的轉化液涂布在SD/-Leu固體培養(yǎng)基平板上作為對照。將平板置于30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3~5 d，觀察酵母菌落的生長情況并計算轉化效率。

轉化效率滿足要求后，將線性化的融合表達載體GADT7-Rec2和獲得的SMARTⅢ和CDSⅢ錨定末端的dscDNA同時轉入YIH Gold[Bait/AbAi]酵母感受態(tài)中，轉化液涂布在含250 ng/mL濃度AbA的SD/-Leu固體培養(yǎng)基平板上，在30℃條件下培養(yǎng)3~5 d后觀察統(tǒng)計培養(yǎng)基上的單菌落數(shù)量。

1.7 陽性克隆鑒定和測序

將能夠在含250 ng/mL濃度AbA的SD/-Leu固體培養(yǎng)基上生長的單菌落進一步在含300 ng/mL濃度AbA的SD/-Leu固體培養(yǎng)基上進行劃線，經過3次劃線后均生長的克隆被認為是陽性克隆。選取陽性克隆，搖菌，提取酵母質粒。以酵母質粒為模板，使用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2試劑盒(Clontech公司，美國)擴增目的片段，將凝膠回收的目的片段連接到T載體上，再進一步轉化到大腸桿菌中，并選取陽性克隆進行測序。引物序列見表1。

2 結果與分析

2.1 不同長度的CKI1基因啟動子活性分析

根據(jù)前人對啟動子活性的研究，F(xiàn)R2序列(1661 bp)是啟動子啟動活性所必需的[6,7]，但對于酵母單雜交來說并不是特別理想的啟動子長度。為進一步獲得啟動子盡可能短的功能序列，本研究在FR2啟動子不同區(qū)間設計引物進行分段擴增。首先將序列截短成(1080 bp)、(1661 bp)、(698 bp)、(1279 bp)、(488 bp)、(1069 bp)、(301 bp)和(882 bp)等8個片段(圖1)，并分別構建了表達載體，轉化擬南芥，觀察轉基因陽性植株胚囊中的啟動子活性。結果表明，只有、、和這4段序列具有啟動子活性。隨后，將這一段序列再次截短為(224 bp)、(581 bp)和(382 bp)等3個片段，分別構建表達載體，轉化擬南芥，觀察轉基因陽性植株胚囊中的啟動子活性。結果表明，只有和這兩段序列具有啟動子的活性(圖2，A~P)，其表達模式與啟動子全長的表達模式一致[5]。研究結果表明，能夠被轉錄因子識別的順式作用元件位于這個區(qū)間的內含子區(qū)域。進一步通過 PLACE和PlantCARE在線啟動子預測工具對該內含子區(qū)域轉錄調控元件進行分析，結果表明該區(qū)域存在對光照、晝夜節(jié)律、厭氧感應，以及細胞分裂素和茉莉酸甲酯兩種植物激素響應的元件(圖3)。

圖2 CKI1基因啟動子片段F5/R2在胚囊中的啟動活性

A和B：大孢子母細胞時期；C和D：功能大孢子時期~FG1時期；E和F：FG2~FG3時期；G和H：FG4時期；I和J：FG5時期；K和L：FG6時期；M~P：FG7時期。兩個極核剛完成融合時，在助細胞和卵細胞中能檢測到啟動子活性，但隨后助細胞和卵細胞中的信號消失，僅反足細胞和中央細胞中具有啟動子活性。標尺為20 μm。

圖3 內含子F5/R2區(qū)域中轉錄調控元件的預測

2.2 酵母單雜交文庫的構建和篩選

2.2.1 誘餌表達載體的構建

本研究選取序列作為誘餌序列，并將3個串聯(lián)重復的片段克隆到AbAi載體中，構建誘餌表達載體3×F5/R2-AbAi。鑒于誘餌表達載體存在報告載體的本底表達，本文首先測試了含有誘餌表達載體的3×-AbAi的YIH Gold酵母菌株(YIH Gold [Bait/AbAi])在不同濃度AbA中生長的情況。與對照相比，AbA能明顯地抑制含有誘餌表達載體的YIH Gold菌株的生長(圖4，A~J)。在含有100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL濃度AbA的培養(yǎng)基中依然有少數(shù)菌落的生長，而250 ng/mL濃度以上的AbA能徹底抑制酵母的生長。因此，250 ng/mL濃度的AbA被確定為后續(xù)文庫篩選最合適的濃度。

2.2.2 酵母單雜交文庫的建立和篩選

dscDNA經檢測滿足建庫要求，融合表達載體GADT7-Rec2轉入YIH Gold[Bait/AbAi]酵母感受態(tài)中的效率為1.125×106cfu/μg，也高于1×105cfu/μg的最低轉化率要求。將含有250 ng/mL AbA的SD/-Leu培養(yǎng)基上篩選到的單克隆菌落接種到新的含有300 ng/mL AbA的SD/-Leu培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，此過程重復兩次。經過3次劃線接種均生長的克隆，被認為是陽性克隆。經過3次篩選最終獲得226個陽性克隆。

圖4 測試含誘餌表達載體的YIH Gold酵母菌株在含有不同濃度AbA的培養(yǎng)基上的生長情況

A：不含AbA；B：100 ng/mL AbA；C：150 ng/mL AbA；D：200 ng/mL AbA；E：250 ng/mL AbA；F：300 ng/mL AbA；G：400 ng/mL AbA；H：500 ng/mL AbA；I：600 ng/mL AbA；J：800 ng/mL AbA。

2.2.3 目的序列的基因功能注釋

將上述獲得的226個陽性克隆進行測序，然后將測序結果與擬南芥基因數(shù)據(jù)庫中的基因進行比對，去除低質量及冗余重復的序列，共獲得66條可讀序列。對這66條可讀序列進行基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)8個具有DNA結合功能的蛋白，包括RING/ FYVE/PHD zinc finger家族蛋白、染色質組裝修飾蛋白、組蛋白、AUX/IAA蛋白等(表2)。根據(jù)中央細胞轉錄組測序數(shù)據(jù)庫[20]，進一步分析了這8個候選基因在中央細胞中的表達情況，除了在中央細胞中不表達，其余7個基因在中央細胞中都有一定的表達量。因此，這7個基因可能是上游轉錄調控因子的候選基因。除了轉錄因子外，本研究還發(fā)現(xiàn)其中36個陽性克隆測序結果為一個功能未知基因—。該基因編碼雜相RNA(miscellaneous RNA)，是一類龐雜的小RNA分子，具有類酶催化、RNA加工和控制基因表達開關的作用[21]。目前對miscellaneous RNA研究極少，其具體的功能機制尚不清楚。

3 討論

3.1 CKI1基因的內含子具有啟動子功能

絕大多數(shù)真核生物的基因是斷裂基因，由外顯子和內含子間隔組成。外顯子是真核生物基因中編碼蛋白質的序列，而內含子為非編碼蛋白序列。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，內含子并非垃圾序列，內含子對基因的表達存在調控作用。目前在很多基因的內含子中發(fā)現(xiàn)了基因表達的調控元件，內含子具有啟動子的功能。Chang[22]發(fā)現(xiàn)豬基因內含子中存在重要的調控元件，可以調控轉錄的起始來增強基因的表達。Salgueino等[23]發(fā)現(xiàn)玉米泛素基因的第一個內含子能夠啟動表達，具有類似于啟動子的功能，對該內含子結構特征的進一步研究發(fā)現(xiàn)該啟動子具有TATA box和CAAT box。謝先芝等[24]對番茄蛋白酶抑制劑Ⅱ基因的內含子序列進行研究，發(fā)現(xiàn)序列具有啟動子活性，能夠啟動下游基因的表達，序列中也存在著類似于真核基因啟動子TATA box的結構。小鼠基因第一個內含子中存在一個基因，該內含子能夠啟動基因的表達，具有類似啟動子的功能[25]。本研究通過對基因啟動子的研究，發(fā)現(xiàn)基因第一個內含子也具有啟動子活性，并且在該區(qū)域內鑒定到了能夠響應光照、晝夜節(jié)律、厭氧反應與植物激素的轉錄調控元件。但具體哪些轉錄調控元件能夠真正介導上游轉錄因子對基因的轉錄激活仍需要進一步研究。

3.2 CKI1基因上游轉錄調控因子的候選基因

轉錄因子是調控真核生物基因表達的重要因子，典型的轉錄因子都有DNA結合區(qū)，不同的轉錄因子與靶基因啟動子的順式作用元件特異性結合并相互作用，從而激活或抑制靶基因的表達。酵母單雜交技術是一種體內鑒定DNA與蛋白質相互作用的有效方法。該系統(tǒng)篩選到的蛋白質是在體內相對自然條件下有結合功能的蛋白質，比體外技術獲得的結果更能體現(xiàn)真核基因表達調控的真實情況。通過酵母單雜交系統(tǒng)，本研究篩選出到7個在中央細胞中表達的轉錄因子基因。同時，考慮到酵母單雜交的假陽性問題，今后有必要對這7個候選基因進一步采用EMSA或者ChIP-qPCR驗證酵母單雜交的篩選結果，以排除可能的假陽性。前期研究表明，基因功能缺失突變體表現(xiàn)出50%的雌配子體敗育表型，由此推測，基因上游轉錄調控因子的突變體可能也具有雌配子體敗育的表型。研究顯示，只有[26]和[27]這兩個基因的功能缺失突變體沒有明顯的雌配子發(fā)育異常表型，其余5個基因的突變體是否具有雌配子發(fā)育異常表型尚不清楚。因此，上述5個基因是今后需要重點關注的候選基因。

表2 目的基因的功能注釋

3.3 轉錄調控因子基因的高通量篩選

酵母單雜交技術目前是鑒定DNA和蛋白質互作以及篩選轉錄因子常用的主流技術。利用特定序列的順式作用元件或者一段啟動子序列篩選目的轉錄因子需要構建cDNA文庫，而cDNA文庫存在基因冗余重復、基因序列不完整和非特異性的問題，容易產生很多的假陽性克隆和重復克隆，為后期的進一步鑒定和驗證增加了大量的工作量。本研究利用酵母單雜交技術對擬南芥雌蕊的cDNA文庫進行了篩選，獲得了226個陽性克隆，僅獲得66條可讀序列，其中轉錄因子基因只有8個，上述陽性克隆存在著大量冗余重復的序列和低質量的序列。為提高酵母單雜交篩選轉錄因子的效率和特異性，轉錄調控因子基因的高通量篩選技術日益受到重視。Castrillo等[16]構建了包含1200個擬南芥轉錄因子的文庫，在96孔板上通過傳統(tǒng)的酵母配對的方式對脂肪酶基因的上游轉錄因子進行了高通量的篩選，找到了的上游調控基因。利用同樣的方法，Ou等[28]構建了包含1589個擬南芥轉錄因子的文庫，篩選到了8個能夠調控基因表達的轉錄因子。Pruneda-Paz等[15]構建了包含1956個擬南芥轉錄因子的文庫，篩選到了能夠結合到基因啟動子區(qū)域的轉錄因子。這種轉錄因子高通量的篩選技術能夠直接篩選到與目的DNA互作的轉錄因子，避免了cDNA文庫篩選存在的過高的假陽性問題和冗余重復序列。這些擬南芥轉錄因子文庫在ABRC網(wǎng)站上都可以訂購獲得，無疑對特定基因上游調控轉錄因子的篩選大有裨益。但上述轉錄因子篩選文庫使用的是擬南芥各器官混合建庫，針對器官或組織特異性的轉錄因子篩選存在一定的局限性，因而進一步完善針對特定發(fā)育時期或器官、組織特異性的轉錄因子文庫具有重要的潛在應用價值。

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Screening and identification ofupstream transcription regulators in

Zhenning Liu1,2,3, Li Yuan2,4, Venkatesan Sundaresan2, Xiaolin Yu3

CKI1 (cytokinin independent 1) is a histidine kinase protein involved in the two-component system, which can activate two-component signalingthe downstream histidine phospho-transfer proteins, playing the essential roles in central cell fate determination and development regulation in embryo sacs. However, studies onupstream transcription regulators are still limited. In the present study, promoter activities with varying fragments were investigated, andupstream transcription regulators were screened and identified by the yeast-one hybrid technique. Results indicatedfragments located in the intron region showed promoter activities in embryo sacs, which is consistent withfull-length promoters. Then three tandem repeats offragments were used to construct the bait expression vector, andpistils were collected for cDNA library construction. Totally, 226 positive clones were screened by the yeast-one hybrid technique, 66 readable sequences were retrieved after removing sequences with low quality and redundant repeats, among which eight proteins could act as DNA-binding proteins. These results provided some important clues to study the molecular function of CKI1 in the transcription regulation network.

; transcription regulation; yeast-one hybrid;

2018-11-21;

2019-02-28

國家自然科學基金項目(編號：31700272，31872110，31460521)，山東省自然科學基金項目(編號：ZR2017PC012)和浙江省農業(yè)新品種選育重大科技專項重點項目子課題(編號：2016C02051-6-1)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31700272, 31460521, 31872110), the Natural Science Foundation of Shandong Province (No. ZR2017PC012) and the Breeding Project of the Sci-tech Foundation of Zhejiang Province (No. 2016C02051-6-1)]

劉振寧，博士，講師，研究方向：植物生殖發(fā)育。E-mail: liuzhenning@lyu.edu.cn

余小林，博士，教授，博士生導師，研究方向：植物功能基因組學。E-mail: xlyu@zju.edu.cn

10.16288/j.yczz.18-314

2019/4/2 17:11:57

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190402.1711.002.html

(責任編委: 張憲省)