布魯菌抗體ELISA檢測(cè)方法比較試驗(yàn)

曹 蕓,封 林,曾 政,黃 誠(chéng),黃 恒,姚 璐

(1.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,重慶 渝北 401120；2.重慶市綦江區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,重慶 綦江 401420)

布魯菌病(簡(jiǎn)稱(chēng)“布病”)是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的世界性人獸共患病,本病對(duì)動(dòng)物主要危害是流產(chǎn)和不孕,但人感染布魯菌后,往往難以治愈。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其收錄入多種動(dòng)物共患病名錄中,我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界每年因布病造成的經(jīng)濟(jì)損失近30億美元[1]。對(duì)于動(dòng)物布病防控,我國(guó)主要采取檢疫淘汰與免疫相結(jié)合的策略[1]。

布病檢測(cè)的常規(guī)方法包括細(xì)菌學(xué)和血清學(xué)方法。細(xì)菌分離鑒定是布病流行、疫情判定及臨床診斷最直接的手段,然而,該方法存在生物安全隱患,且耗時(shí)長(zhǎng),在大規(guī)模臨床檢疫檢測(cè)中不適用[2]。血清學(xué)檢測(cè)仍是當(dāng)前診斷動(dòng)物布病的主要方法,包括虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等[3]。目前《國(guó)家布魯菌病防治計(jì)劃(2016-2020年)》中規(guī)定的布魯菌抗體血清學(xué)確診方法有試管凝集試驗(yàn)(SAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(iELISA)和競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)[4]。當(dāng)臨床開(kāi)展大規(guī)模的血清學(xué)檢測(cè)時(shí),試管凝集試驗(yàn)不僅操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng),而且存在特異性不高的問(wèn)題,目前OIE已不推薦使用該方法[5]；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)雖是公認(rèn)的確診方法,但試驗(yàn)操作復(fù)雜,需有良好的試驗(yàn)設(shè)施和訓(xùn)練有素的人員作準(zhǔn)確的組分滴定、試劑保存和結(jié)果判斷[3-5],故在檢測(cè)中并不常用；ELISA方法具有通量大、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果易于判定等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于日常檢疫檢測(cè)。

為了客觀評(píng)價(jià)布魯菌抗體診斷試劑,提供臨床布病檢測(cè)參數(shù),本研究選取3家不同單位的ELISA試劑盒對(duì)田間采集的經(jīng)CFT檢驗(yàn)的180份血清樣本(牛、羊血清各90份)分別進(jìn)行檢測(cè),比較不同ELISA試劑盒之間以及試劑盒與CFT之間的符合率,確定診斷試劑盒的檢測(cè)效果。

1 材料與方法

1.1 血清樣本 共計(jì)180份(其中牛、羊血清各90份),由本實(shí)驗(yàn)室從田間采集、保存。

1.2 主要試劑 牛/羊布魯菌間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(iELISA-IVDC),批號(hào)2017011；布魯菌競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(cELISA-IVDC),批號(hào)2017011；購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。cELISA抗體檢測(cè)試劑盒(cELISA-Sva),購(gòu)自Svanova公司,貨號(hào)10-2701-02；iELISA抗體檢測(cè)試劑盒,分別購(gòu)自Svanova公司(iELISA-Sva)和IDEXX公司(iELISA-idexx),貨號(hào)分別為104890和BAT1132T；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)所用的補(bǔ)體、溶血素、抗原、對(duì)照陰性和陽(yáng)性血清,全部購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.3 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)所用紅細(xì)胞 按參考文獻(xiàn)[3]制備。

1.4 方法

1.4.1 符合率試驗(yàn) 將180份血清樣本分別采用iELISA-IVDC、 cELISA-IVDC、 iELISA-Idexx、 iELISA-Sva和cELISA-Sva進(jìn)行檢測(cè),并用國(guó)際貿(mào)易指定的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)進(jìn)行最終定性檢測(cè),確定試劑盒與CFT間的符合率,以及不同試劑盒之間的符合率。

1.4.2 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 具體按動(dòng)物布病診斷技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18646—2002)[6]及《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(2000版)“布魯菌病補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)抗原與陰、陽(yáng)性血清制造及檢驗(yàn)規(guī)程”中提及的方法進(jìn)行[7]。

2 結(jié)果

2.1 不同試劑盒與CFT之間符合率,其結(jié)果見(jiàn)表1～表5。

表1 iELISA-IVDC試劑盒與CFT的符合率

表1結(jié)果顯示,以CFT檢測(cè)結(jié)果為最終判定標(biāo)準(zhǔn),IVDC研制的iELISA-IVDC試劑盒與CFT的結(jié)果符合率為98.9%。

表2 cELISA-IVDC試劑盒與CFT的符合率

表2結(jié)果顯示,以CFT檢測(cè)結(jié)果為最終判定標(biāo)準(zhǔn),IVDC研制的cELISA-IVDC試劑盒與CFT的結(jié)果符合率為96.7%。

表3 iELISA-Sva試劑盒與CFT的符合率

表3結(jié)果顯示,以CFT檢測(cè)結(jié)果為最終判定標(biāo)準(zhǔn),SVANOVA研制的iELISA-Sva試劑盒與CFT的結(jié)果符合率為93.3%。

表4 cELISA-Sva試劑盒與CFT的符合率

表4結(jié)果顯示,以CFT檢測(cè)結(jié)果為最終判定標(biāo)準(zhǔn),SVANOVA研制的cELISA-Sva試劑盒與CFT的結(jié)果符合率為89.4%。

表5 iELISA-Idexx試劑盒與CFT的符合率

表5結(jié)果顯示,以CFT檢測(cè)結(jié)果為最終判定標(biāo)準(zhǔn),IDEXX研制的iELISA-Sva試劑盒與CFT的結(jié)果符合率為87.8%。

2.2 不同來(lái)源試劑盒間符合率,結(jié)果見(jiàn)表6和表7。

表6 IVDC試劑盒間的符合率比較

表6結(jié)果表明,IVDC研制的cELISA-IVDC與iELISA-IVDC抗體檢測(cè)試劑盒的符合率為98.3%。

表7 SVANOVA試劑盒間的符合率比較

表7結(jié)果表明,SVANOVA研制的的cELISA-Sva試劑盒與iELISA-Sva試劑盒的符合率為91.7%。

3 討論與結(jié)論

3.1 比較試驗(yàn)中采用了180份田間樣品,其中經(jīng)CFT檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本約占總數(shù)的2/3。選擇3個(gè)不同生產(chǎn)單位的布魯菌抗體檢測(cè)診斷試劑盒對(duì)所有樣品進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)不同單位生產(chǎn)的布病診斷試劑盒檢測(cè)結(jié)果之間存在一定的差異。鑒于CFT是國(guó)際布病血清學(xué)檢測(cè)公認(rèn)的確診方法,因此本試驗(yàn)所用樣本均以CFT檢測(cè)結(jié)果為最終判定標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)比對(duì)試驗(yàn),iELISA-IVDC和cELISA-IVDC與CFT的符合率最高；對(duì)同一單位的產(chǎn)品,iELISA-IVDC與cELISA-IVDC之間的符合率也高于其他生產(chǎn)單位的布病試劑盒。對(duì)于同一單位的不同產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果存在差異,分析其原因主要與iELISA與cELISA兩者反應(yīng)原理不同有關(guān),iELISA僅僅檢測(cè)了血清中的IgG類(lèi)抗體,而cELISA同時(shí)檢測(cè)了IgG和IgM兩種類(lèi)型的抗體,理論上cELISA檢測(cè)的敏感性要高于iELISA。

3.2 對(duì)于布魯菌抗體ELISA檢測(cè)試劑盒,近年來(lái)獲批的國(guó)產(chǎn)試劑盒主要以中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研發(fā)為主[8-10],而在我國(guó)市場(chǎng)銷(xiāo)售的進(jìn)口布魯菌抗體ELISA試劑盒,包括瑞典Svanova公司的iELISA試劑盒、cELISA試劑盒以及美國(guó)IDEXX公司的iELISA試劑盒。從臨床實(shí)踐來(lái)看,進(jìn)口的cELISA試劑盒中的單克隆抗體、iELISA試劑盒中的酶標(biāo)二抗均為凍干保存,用時(shí)復(fù)溶,剩余的復(fù)溶后的單克隆抗體需-20℃保存,且保存時(shí)間有限制；國(guó)產(chǎn)的cELISA-IVDC/iELISA-IVDC檢測(cè)試劑盒中的所有試劑均在2℃ ～8℃保存,操作簡(jiǎn)便,且不涉及抗體凍融,能更穩(wěn)定且更有利于試劑盒板條的多次拆分使用。另外,進(jìn)口試劑盒樣本和二抗作用時(shí)間均為1 h,國(guó)產(chǎn)試劑盒樣本和二抗作用時(shí)間均為30 min,試驗(yàn)用時(shí)較短。比較發(fā)現(xiàn)IVDC的布病試劑盒在操作時(shí)間上具有明顯優(yōu)勢(shì),且檢測(cè)結(jié)果的符合率略高于同類(lèi)進(jìn)口制品,說(shuō)明國(guó)產(chǎn)IVDC布病ELISA診斷試劑盒具有較好的應(yīng)用前景。