雞巨型艾美耳球蟲(chóng)早熟株免疫效果試驗(yàn)

李瑞琪,王天成,鄭明學(xué),白 瑞,張 黎,張雪松,康慧鑫,楊洪靜,雷 璇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷 030801)

雞球蟲(chóng)病是雞球蟲(chóng)寄生在雞腸道黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)引起的一種原蟲(chóng)病,對(duì)現(xiàn)代養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。已報(bào)道有9種雞球蟲(chóng),其中巨型艾美耳球蟲(chóng)(E.maxima)是危害最嚴(yán)重的蟲(chóng)種之一,也是集約化養(yǎng)殖最常見(jiàn)的3種球蟲(chóng)之一,呈世界性分布。E.maxima寄生于雞小腸中段,影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收并易引起繼發(fā)性腸炎[1],對(duì)雞的生長(zhǎng)影響明顯,若致病性強(qiáng)的地方蟲(chóng)株感染5萬(wàn)個(gè)卵囊/只,雞的相對(duì)增重率可下降50%以上[2]。

目前,防治雞球蟲(chóng)病的主要手段是使用抗球蟲(chóng)藥進(jìn)行化學(xué)防治。但是,藥物防治面臨著日益嚴(yán)重的三大問(wèn)題：耐藥蟲(chóng)株的迅速出現(xiàn)；藥物殘留問(wèn)題；對(duì)免疫力產(chǎn)生抑制。疫苗免疫來(lái)防控雞球蟲(chóng)病可以解決抗球蟲(chóng)藥遇到的難題,將來(lái)必將取代化學(xué)藥物在球蟲(chóng)病控制中占據(jù)的主導(dǎo)地位[3-4]。目前,國(guó)內(nèi)外已有多種球蟲(chóng)疫苗推廣并應(yīng)用到養(yǎng)雞生產(chǎn)[5]。但E.maxima不同地理株之間免疫原性差異很大,常因不同地理株的出現(xiàn)導(dǎo)致免疫失敗[6]。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室從山東臨沂某雞場(chǎng)分離、鑒定獲得1株E.maxima親本株,經(jīng)14代早熟選育,得到一株潛隱期縮短了11 h的E.maxima早熟株。但是該弱毒蟲(chóng)株對(duì)雛雞的最小免疫劑量尚不明確,為此,本研究用不同劑量的E.maxima早熟株接種雛雞,用親本株進(jìn)行攻毒,測(cè)定相對(duì)增重率、卵囊減少率、RLS、ACI,確定使雛雞獲得良好免疫效果的最低早熟株接種量,從而為正確使用球蟲(chóng)疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蟲(chóng)株 巨型艾美耳球蟲(chóng)山東株(Msd)和巨型艾美耳球蟲(chóng)山東早熟株(PMsd)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室保存與提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4日齡SPF雛雞,公母各半,由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供SPF種雞蛋孵化而來(lái)。

1.3 一次免疫試驗(yàn) 挑選體重相近的4日齡SPF雞70只,空腹稱重,隨機(jī)分為7組(T1～T5、C1和C2組),每組10只,其中T1～T5組為免疫攻毒組,C1組為攻毒對(duì)照組,C2組為空白對(duì)照組。T1～T5組免疫接種 PMsd,免疫劑量分別為：50、100、200、400、600個(gè)孢子化卵囊/只,免疫后5～9 d,每天分別收集各組所有糞便,稱重,測(cè)定OPG,計(jì)算卵囊產(chǎn)量；于11日齡(第一次免疫后第7天)空腹稱重各組雞,同時(shí)用親本株Msd對(duì)T1～T5組和C1組進(jìn)行攻毒,劑量為10×104個(gè)孢子化卵囊/只。攻毒后每日觀測(cè)雞的臨床狀況、死亡情況和血便堆數(shù)。攻毒后第5～7天觀測(cè)各組雞的卵囊排出量、OPG,計(jì)算卵囊減少率。攻毒后第7天稱重,剖解雞,觀測(cè)小腸病變并計(jì)算RLS、相對(duì)增重率、相對(duì)保護(hù)率、卵囊減少率和ACI。

1.4 二次免疫試驗(yàn) 挑選體重相近的4日齡SPF雞70只,空腹稱重,隨機(jī)分為7組(TT1～TT5、CC1和CC2組),每組10只,其中TT1～TT5組為二次免疫攻毒組,CC1組為攻毒對(duì)照組,CC2組為空白對(duì)照組,TT1～TT5組雞于4日齡時(shí)進(jìn)行早熟株第一次免疫,免疫劑量分別為：50、100、200、400、600 個(gè)孢子化卵囊/只,于11日齡(第一次免疫后第7天)進(jìn)行第二次免疫,免疫劑量分別為：100、200、400、800、1 200個(gè)孢子化卵囊/只,第二次免疫后5～9 d,每天分別收集各組所有糞便,稱重,測(cè)定OPG,計(jì)算孢子化卵囊減少率。于二次免疫后第10天(21日齡)空腹稱重各組雞,同時(shí)用親本株Msd對(duì)TT1～TT5組和CC1組進(jìn)行攻毒,劑量為10×104個(gè)孢子化卵囊/只,攻毒后觀察和測(cè)定指標(biāo)同一次免疫試驗(yàn)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) 卵囊減少率=(不免疫攻毒組卵囊平均產(chǎn)量-免疫攻毒組卵囊平均產(chǎn)量)/不免疫攻毒組卵囊平均產(chǎn)量×100%；相對(duì)卵囊產(chǎn)量(ROP)=免疫攻毒組的卵囊產(chǎn)量/不免疫攻毒組的卵囊產(chǎn)量×100%；病變記分減少率(RLS)=(不免疫攻毒組的平均病變記分-免疫攻毒組的平均病變記分)/不免疫攻毒組的平均病變記分×100%；相對(duì)增重率=(試驗(yàn)組雞平均增重/空白組雞平均增重)×100%；抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)=(存活率+相對(duì)增重率)-(病變值+卵囊值)；相對(duì)保護(hù)率(%)=(不免疫攻毒組OPG—免疫攻毒組OPG)÷不免疫攻毒組OPG×100%[8-9]。

免疫效果判定標(biāo)準(zhǔn)：E.maxima早熟株最小免疫劑量是指對(duì)強(qiáng)毒株產(chǎn)生抵抗力,達(dá)到良好免疫效果(相對(duì)增重率≥85%,RLS≥70%,卵囊減少率≥75%,相對(duì)保護(hù)率≥90%和ACI≥170)的最小免疫接種劑量。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 一次免疫試驗(yàn) 各免疫攻毒組雞均無(wú)血便、無(wú)死亡現(xiàn)象。免疫劑量為50個(gè)孢子化卵囊/只時(shí)(T1組),卵囊減少率可達(dá)84.42%,說(shuō)明已對(duì)雞體產(chǎn)生部分免疫保護(hù)。 T2、T3、T4、T5組 RLS均≥70%,卵囊減少率≥75%,因此判定為有保護(hù)力。一次免疫劑量≤300個(gè)孢子化卵囊/只的T1、T2、T3組的相對(duì)免疫保護(hù)率＜90%。而免疫劑量為400個(gè)孢子化卵囊/只及以上時(shí),相對(duì)增重率≥85%,RLS≥70%,卵囊減少率≥75%,相對(duì)保護(hù)率≥90%,抗球蟲(chóng)指數(shù)≥170,符合標(biāo)準(zhǔn),說(shuō)明免疫劑量為400個(gè)孢子化卵囊/只時(shí),早熟株可達(dá)到良好免疫效果,具備良好的免疫原性,可將早熟株一次免疫的最小免疫劑量定為400個(gè)孢子化卵囊/只(見(jiàn)表1和圖1)。

2.2 二次免疫試驗(yàn) 各免疫攻毒組和空白組雞均無(wú)血便、無(wú)死亡現(xiàn)象。TT1組RLS為66.67%,孢子化卵囊減少率為93.29%,ACI為173.34,說(shuō)明已對(duì)雞體產(chǎn)生一定免疫保護(hù)。 TT2、TT3、TT4、TT5組的 RLS≥70%、卵囊減少率≥75%、相對(duì)增重率≥85%,ACI≥170,均達(dá)到了良好免疫效果。故早熟株兩次免疫的最小免疫劑量可定為一免100個(gè)孢子化卵囊/只、二免200個(gè)孢子化卵囊/只(見(jiàn)表2及圖2)。

圖1 一次免疫不同劑量E.maxima早熟株對(duì)抗球蟲(chóng)指數(shù)的影響

表1 E.maxima早熟株一次免疫保護(hù)效果

2.3 E.maxima早熟株一次免疫對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能及卵囊產(chǎn)量的影響 在一次免疫期間(4～11日齡)試驗(yàn)雞群的精神狀態(tài)未見(jiàn)異常,隨著免疫劑量增加,免疫組雞平均增重、相對(duì)增重率均下降。免疫劑量在50～600個(gè)孢子化卵囊/只時(shí),早熟株組雞的相對(duì)增重率均在90%以上；免疫接種后卵囊產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)。各免疫組雞無(wú)死亡、無(wú)血便現(xiàn)象,見(jiàn)表3。

表2 E.maxima早熟株二次免疫保護(hù)效果

圖2 二次免疫不同劑量E.maxima早熟株對(duì)抗球蟲(chóng)指數(shù)的影響

表3 一次免疫對(duì)雞生長(zhǎng)性能及孢子化卵囊產(chǎn)量的影響

2.4 E.maxima早熟株二次免疫對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能的影響 在兩次免疫期間(4～21日齡)試驗(yàn)雞群的精神狀態(tài)未見(jiàn)異常,隨著免疫劑量增加,二次免疫組雞平均增重、相對(duì)增重率均下降,一免/二免劑量在50個(gè)孢子化卵囊/100～400個(gè)孢子化卵囊/800個(gè)孢子化卵囊/只時(shí),雞相對(duì)增重率均在90%以上；各組雞無(wú)死亡、無(wú)血便現(xiàn)象,見(jiàn)表4。

表4 二次免疫對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能影響

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明,用不同免疫劑量的E.maxima早熟株對(duì)試驗(yàn)雛雞進(jìn)行一次免疫,免疫后以10×104個(gè)孢子化卵囊/只同源親本株攻毒,各免疫組的卵囊產(chǎn)量比非免疫攻毒組明顯減少。表明E.maxima早熟株(PMsd)具有良好免疫原性,不同免疫劑量均能誘發(fā)雛雞產(chǎn)生保護(hù)力。

本試驗(yàn)對(duì)E.maxima早熟株一次免疫與二次免疫效果進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),二次免疫組攻毒后相對(duì)增重率、卵囊減少率、相對(duì)保護(hù)率、ACI值高于一次免疫組；當(dāng)免疫劑量為一免50～200個(gè)孢子化卵囊/只,二免劑量為100～400個(gè)孢子化卵囊/只時(shí),二免組的RLS高于一免組；二免后ROP低于一免組。無(wú)論對(duì)4日齡SPF雞進(jìn)行一次免疫還是先后進(jìn)行兩次免疫,隨著免疫劑量的增加,免疫攻毒組雞的ROP降低,相對(duì)增重率、卵囊減少率、相對(duì)保護(hù)率、RLS、ACI等升高,產(chǎn)生的免疫保護(hù)力越大,但疫苗株對(duì)雛雞增重的不良影響也越大。進(jìn)行兩次免疫的效果優(yōu)于只進(jìn)行一次免疫。

杜愛(ài)芳等[10]研究了GC02雞球蟲(chóng)疫苗的免疫效果,結(jié)果表明二次免疫的效果優(yōu)于一次免疫和三次免疫；二次免疫能有效地控制雞球蟲(chóng)病的發(fā)生,并對(duì)雛雞有明顯的促生長(zhǎng)作用。卞國(guó)志等(2006)[11]研究了不同免疫劑量和免疫次數(shù)對(duì)雞毒害艾美耳球蟲(chóng)免疫保護(hù)力的影響,表明在籠養(yǎng)條件下,2次免疫處理組各項(xiàng)指標(biāo)明顯優(yōu)于1次免疫組,由于較少或基本缺乏卵囊的循環(huán)感染,1次免疫后所激發(fā)的免疫力持續(xù)時(shí)間較短,要達(dá)到球蟲(chóng)病的免疫控制,以進(jìn)行2次免疫接種為好。

本試驗(yàn)以分離誘導(dǎo)的山東E.maxima早熟株對(duì)同源強(qiáng)毒株的免疫效果進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,該早熟株一次免疫的最小免疫劑量為400個(gè)孢子化卵囊/只；兩次免疫的最小免疫劑量為一免100個(gè)孢子化卵囊/只、二免200個(gè)孢子化卵囊/只,為研制適合一定區(qū)域的球蟲(chóng)地方疫苗提供新的疫苗蟲(chóng)株和理論依據(jù)。