糜子矮稈突變體778農(nóng)藝性狀調(diào)查及其對GA的敏感性分析

張 博，賈小平，*，楊德智，趙 淵，戴凌峰，寇淑君，張小梅，侯典云，朱學(xué)海，*

(1.河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471000； 2.張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北 張家口 075000)

農(nóng)作物育種實踐中，作物株高與抗倒伏、產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀緊密相關(guān)。對植物株高進行改良，已成為創(chuàng)造理想株型的主要技術(shù)路線，而獲得新的優(yōu)異種質(zhì)資源，則是株高改良中必不可少的一步。矮稈性狀作為一個常見性狀，曾推動了第一次“綠色革命”，使得小麥和水稻的產(chǎn)量得以大幅提升。優(yōu)質(zhì)的矮稈資源可以用來培育矮化且高產(chǎn)的新品種，并且可以有效解決倒伏問題[1-5]。因此，深入研究高矮稈不同農(nóng)藝性狀之間的差別以及探索控制株高的內(nèi)在分子機制對于進一步提高作物產(chǎn)量至關(guān)重要。

目前對于矮稈突變體的研究較多，如王益軍等[6]對一份玉米顯性矮稈突變體進行了遺傳分析，研究表明，玉米顯性矮稈突變體D8、D9的典型突變表型為植株矮化、葉片窄而濃綠、分蘗增加、花期延遲、雌穗上著生花藥、對外源赤霉素施用不敏感，矮稈基因D-10被定位在玉米第2染色體上。陳立[7]比較了玉米矮稈突變體K125d與其同源自交系K211的農(nóng)藝經(jīng)濟性狀差異，研究表明與同源自交系K211比較，K125d生育期極顯著延長，穗位高極顯著降低，平均株高降低53.07%，葉片重疊密集，葉片數(shù)目和葉寬極顯著增加，但葉夾角極顯著減小，利于理想株型建成，單株產(chǎn)量降低34.41%，但穗長和穗行數(shù)差異不顯著，有增產(chǎn)潛力，其矮化原因是莖稈細(xì)胞長度縮短導(dǎo)致的節(jié)間長度縮短。王隨寶等[8]對幾個冬小麥矮稈種質(zhì)材料做父本時的矮化作用進行了研究評價，鑒定篩選出陜160、西北矮個子和臨5064/煙農(nóng)15三種類型的優(yōu)異矮稈種質(zhì)，并提出了這些優(yōu)異種質(zhì)的利用設(shè)想。

關(guān)于矮稈基因的深入研究，也已經(jīng)有相當(dāng)多的報道。如小麥Rht基因，其編碼的蛋白抑制了赤霉素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而導(dǎo)致植株矮化[9]；水稻sd1基因也有很多相關(guān)報道，由于其編碼的缺陷型GA20氧化酶，從而影響了赤霉素的生物合成途徑，使植株高度受到影響[10]；甘藍(lán)型油菜一個半顯性矮稈突變體中發(fā)現(xiàn)DS-1基因位于A6染色體上，編碼作為赤霉素受體的DELLA蛋白[11]。對矮稈基因的研究表明，矮稈性狀與赤霉素的生物合成和轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。

糜子作為一種比較抗旱的禾谷類作物，具有穩(wěn)定的生產(chǎn)力和較好的經(jīng)濟效益，在旱作農(nóng)業(yè)以及抗災(zāi)救災(zāi)中是其他作物不可替代的[12-17]。關(guān)于糜子的研究多是關(guān)于抗病蟲害以及產(chǎn)量構(gòu)成因素的分析，而對于其矮化突變體的誘導(dǎo)以及相關(guān)基因挖掘至今未見相關(guān)報道[18-23]。因此，本研究從一份糜子矮稈突變體材料778入手，對糜子苗期進行形態(tài)學(xué)觀察以及7個田間農(nóng)藝性狀進行測定，并通過噴施赤霉素處理來進一步探索其矮化原因是否與赤霉素生物合成和轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)，為進行控制突變性狀的基因克隆和功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實驗于2017年在河南科技大學(xué)農(nóng)場進行，材料為糜子原始高稈材料260，以及矮稈突變材料778(由高稈260經(jīng)EMS誘變)，材料種子均由張家口農(nóng)業(yè)科學(xué)院朱學(xué)海研究員提供。

1.2 實驗藥品和儀器

KH2PO4，KNO3，Ca(NO3)·4H2O，MgSO4·7H2O，H3BO3，MnCl·4H2O，ZnSO4·7H2O，CuSO4·5H2O，NaMoO4·2H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O，Na-EDTA，無水乙醇，以上試劑均為國產(chǎn)分析純。赤霉素為美國Sanland公司生產(chǎn)的分析純試劑。光照培養(yǎng)箱GZX-150B由上海坤天儀器有限公司生產(chǎn)、微量移液器由Eppendorf公司生產(chǎn)。

1.3 材料培養(yǎng)和處理

1.3.1 田間種植及管理

糜子矮稈突變體778、原始高稈260于2017年5月18日播種于河南科技大學(xué)開元校區(qū)試驗田，株距5 cm，行距40 cm，每品種種植3行，行長2 m，生長期間對田間進行標(biāo)準(zhǔn)化管理，在糜子生育期拍照記錄表型形態(tài)。

1.3.2 室內(nèi)植物材料和生長狀態(tài)

將實驗材料種子置于4 ℃冰箱48 h，之后用4個塑料小盆(10 cm×10 cm)裝一半泥土，每個小盆種植150粒種子，2盆原始材料，2盆矮稈突變材料，置于恒溫培養(yǎng)箱中，每日澆水等待萌發(fā)。等待材料生長至四葉期，進行水培移植，水培方法參照Hoagland方法進行，每3 d更換一次培養(yǎng)液。

1.3.3 赤霉素噴施處理

使用50、100、200 mg·L-1赤霉素溶液，分別噴施不同處理組，對照組用水進行噴施。以上處理間隔6 d噴施一次。

1.4 表型數(shù)據(jù)的測定

1.4.1 田間表型數(shù)據(jù)的測量

糜子成熟后，在試驗田隨機選取長勢均一糜子矮稈突變體778、糜子原始高稈材料260各10株進行株高、穗長、節(jié)間長、節(jié)間數(shù)、種子長、種子寬和穗粒數(shù)這7個田間農(nóng)藝性狀的測定。如果有分蘗，測主莖的農(nóng)藝性狀。

1.4.2 赤霉素處理組數(shù)據(jù)的測量

從赤霉素處理植株開始，每隔6 d對赤霉素實驗組和對照組株高、根長進行測量并記錄數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計分析

將記錄好的數(shù)據(jù)用Excel處理，并計算各濃度下高稈材料260與矮稈突變材料778的GA敏感系數(shù)。利用SPSS17.0進行單因素的方差分析，并用鄧肯法進行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 矮稈突變體的外觀形態(tài)分析

如圖1-a和b所示，在苗期，矮稈突變體778和原始材料高稈260的株高已出現(xiàn)明顯差異。矮稈突變體778的地上基部節(jié)和第一、第二伸長節(jié)均短于原始高稈材料260。此外矮稈突變體的葉片短而寬，葉色深綠，而高稈材料的葉片細(xì)長，葉色較淺。成熟后高稈材料的穗較長，且松散，而矮稈材料的穗短，較緊實；高稈材料從穗下第一節(jié)開始，5個節(jié)間長度均大于矮稈突變材料。

2.2 矮稈突變體的農(nóng)藝性狀分析

由表1可以看出，矮稈突變體778的穗長為11.35 cm，高稈260的穗長為24.58 cm，差異極顯著(P<0.01)。矮稈突變體778的節(jié)間數(shù)為4.7個，高稈260的節(jié)間數(shù)為5.5個，差異極顯著(P<0.01)。矮稈突變體778的種子長為0.30 cm，高稈260的種子長為0.25 cm，差異顯著(P<0.05)。矮稈突變體778和高稈260的種子寬差異不顯著(P>0.05)，高稈260的種子寬略大于矮稈突變體778(圖2)。矮稈突變體778的穗粒數(shù)和株高分別為129.9粒和75.5 cm，高稈260的穗粒數(shù)和株高分別為523粒和124.6 cm，差異極顯著(P<0.01)。

a，苗期矮稈突變體778(右側(cè))和原始材料高稈260(左側(cè))株高比較；b，成熟后矮稈突變體778(右側(cè))和原始材料高稈260(左側(cè))穗與節(jié)間長比較。a， Comparison of plant height of dwarf mutant 778 (the right) and the original high straw 260 (the left); b， Comparison of spikes and internode length of mature dwarf mutant 778 (the right) and original high straw 260 (the left).圖1 原始高稈260和矮稈突變體778的外觀形態(tài)比較Fig.1 Comparison of the appearance of the original high straw 260 and the dwarf mutant 778

表1 兩種材料部分表型數(shù)據(jù)

同列不同行數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，沒有相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

The data in the same column without the same lowercase or capital letters showed the significant different at the level of 0.05 or 0.01， respectively.

矮稈突變體778的第一節(jié)間長度、第二節(jié)間長度、第三節(jié)間長度、第四節(jié)間長度、第五節(jié)間長度分別為：10.45、11.33、14.88、13.01、13.08 cm，高稈260的第一節(jié)間長度、第二節(jié)間長度、第三節(jié)間長度、第四節(jié)間長度、第五節(jié)間長度分別為：14.79、21.18、19.91、20.93、15.86 cm，差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

2.3 赤霉素敏感性分析

根據(jù)表2可以看出來，矮稈材料在3個赤霉素處理濃度下株高均大于空白對照，且隨著時間的延長，處理組較對照組株高差異變大，處理組株高明顯大于對照組株高；從第12天(第2次測量)開始，隨著GA濃度的增加，矮稈突變體株高也呈現(xiàn)遞增的趨勢。矮100的GRI值大于矮50的GRI值(GRI=1.15、1.14、1.21)且略大于矮200的GRI值(GRI=1.08、1.25、1.43)，說明矮稈突變體對于100 mg·L-1的赤霉素濃度更為敏感。根據(jù)表中數(shù)據(jù)可以看出，矮稈突變體在經(jīng)過3次赤霉素噴施后，其株高可以恢復(fù)至高稈正常株高，說明導(dǎo)致矮稈突變的原因可能與赤霉素合成途徑有關(guān)。

a，種子長度比較；b，種子寬度比較。a， Comparison of seed length; b， Comparison of seed width.圖2 矮稈突變體778(上部)和高稈260(下部)穗粒比較Fig.2 Grain comparison of dwarf mutant 778 (the upper) and high stalk 260 (the lower)

表2 高稈材料260與矮稈突變材料778的幼苗高度及GRI值

Short 50、Short 100、Short 200：矮稈突變體778分別用50、100、200 mg·L-1GA處理；High 50、High 100、High 200：高稈260分別用50、100、200 mg·L-1GA處理。第1次測量的時間為赤霉素處理后的第6天；第2次測量的時間為赤霉素處理后的第12天；第3次測量的時間為赤霉素處理后的第18天。

Short 50， Short 100， Short 200: Dwarf mutant 778 was treated with 50， 100， 200 mg·L-1GA; High 50， High 100， High 200: High straw 260 was treated with 50， 100， 200 mg·L-1GA， respectively. The first measurement time was the sixth day after gibberellin treatment， the second measurement time was the twelfth day after gibberellin treatment， and the third measurement time was the eighteenth day after gibberellin treatment.

2.4 不同質(zhì)量濃度赤霉素對糜子單個性狀的影響

由圖3-A可以看出，第6天和第12天的矮稈材料株高在赤霉素為0、50、100、200 mg·L-1不同組之間差異不顯著(P>0.05)。第6天時，赤霉素200 mg·L-1組的高稈材料的株高要顯著高于赤霉素50 mg·L-1組(P<0.05)，其他組之間無顯著差異(P>0.05)。第12天時，赤霉素200 mg·L-1組的高稈材料的株高要極顯著高于赤霉素50 mg·L-1組(P<0.05)，顯著高于其他組(P<0.05)。

不同質(zhì)量濃度處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，沒有相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。The uppercase letters or lowercase letters on the bars showed significantly different at the level of 0.01 or 0.05， respectively.圖3 不同質(zhì)量濃度赤霉素對糜子株高、根長和GRI的影響Fig.3 Effect of different concentrations of gibberellin on plant height， root length and GRI of Panicum miliaceuml

由圖3-B可以看出，第6天和第12天的矮稈材料根長在赤霉素為0、50、100、200 mg·L-1不同組之間差異不顯著(P>0.05)。第6天時，赤霉素0 mg·L-1組的高稈材料根長要顯著高于赤霉素50 mg·L-1和赤霉素200 mg·L-1組(P<0.05)，與赤霉素100 mg·L-1組之間無顯著差異(P>0.05)。第12天時，赤霉素0 mg·L-1和赤霉素200 mg·L-1組的高稈材料根長要顯著高于赤霉素50 mg·L-1組(P<0.05)。

由圖3-C可以看出，第6天和第12天，赤霉素不同濃度組的矮稈材料GRI無顯著差異(P>0.05)。第6天和第12天，高稈材料GRI在赤霉素不同濃度組之間差異顯著(P<0.05)，且隨赤霉素濃度的遞增呈現(xiàn)遞增趨勢。

3 討論

目前，關(guān)于糜子矮稈突變體并無相關(guān)報道，但水稻中已有80多個矮化突變體被報道，根據(jù)表型性狀的不同，將它們分為多種類型。本研究首次報道了糜子矮稈突變體，通過對糜子矮稈突變體778進行形態(tài)學(xué)觀察以及對田間農(nóng)藝性狀進行測定，結(jié)果顯示，矮稈突變體778的穗長和株高極顯著低于高稈260(P<0.01)，這與Chen等[24]在由小麥品種Sumai 3的乙基甲基磺酸鹽處理產(chǎn)生的矮稈突變體NAUH164的研究結(jié)果相一致。矮稈突變體778的種子長也顯著高于高稈，和Lu等[25]在小麥新型矮化突變體NM9中的研究結(jié)果一致。本研究揭示了矮稈突變體共有的一些典型特征，為糜子矮稈資源的利用和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)于植株矮化的分子機制已經(jīng)有很多報道。已從水稻中克隆出30多個矮化相關(guān)基因，它們大多參與赤霉素合成或轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Ueguchi-Tanaka等[26]報道了一種新的GA不敏感的水稻矮稈突變體gid1，其GID1基因編碼與激素敏感性脂肪酶相似的未知蛋白質(zhì)，重組谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-GID1僅對生物活性GAs具有高親和力，而對應(yīng)于3個gid1等位基因的突變GST-GID1不具有GA結(jié)合親和力。此外，GID1在酵母細(xì)胞中以GA依賴性方式與水稻DELLA蛋白SLR1結(jié)合。GID1過表達(dá)導(dǎo)致GA-過敏表型，這些結(jié)果表明，GID1是介導(dǎo)水稻GA信號傳導(dǎo)的可溶性受體。Spielmeyer等[27]通過來自水稻基因組的序列數(shù)據(jù)與先前的作圖研究相結(jié)合，以在染色體1上的sd-1的預(yù)測圖譜位置定位推定的GA 20-氧化酶基因(Os20ox2)，提出半矮化(sd-1)表型是由于缺陷的20-氧化酶GA生物合成酶引起的伸長節(jié)中活性GAs缺乏的結(jié)果。王翠紅等[28]將麗江新團黑谷用EMS(ethyl-methane sulfonate，甲基磺酸乙酯)誘變，通過圖位克隆和功能基因互補驗證確認(rèn)該突變體是一個新的D1基因等位突變體，其D1基因在第6外顯子與內(nèi)含子結(jié)合處的第2 522位堿基由G突變?yōu)锳，導(dǎo)致第6外顯子被剪切掉而無法翻譯出有功能的Gα亞基。

綜上所述，植株矮化與赤霉素合成或轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。對于矮稈突變體，可以通過赤霉素敏感性實驗，若突變體在赤霉素處理后可以恢復(fù)至正常株高，則說明矮化突變與赤霉素合成通路有關(guān)；反之，若對赤霉素處理不敏感，則可能是赤霉素傳導(dǎo)途徑或其他途徑改變導(dǎo)致的矮化。因此在本研究中，我們通過使用GA處理矮稈突變體，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過噴施赤霉素后，矮稈突變體可以恢復(fù)至正常株高，從而進一步判斷其矮化原因與赤霉素合成途徑有關(guān)。