磁場和基質對中華鱉孵化性比和孵化率的影響

劉 飛，李戈銳，張家瑜，徐 倩，楊福忠，李 明，史習剛，謝春華，席在星

(1.湖南文理學院，環(huán)洞庭湖水產健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，水產高效健康生產湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000；2.湖南省漢壽縣特種水產科學研究所，湖南常德 415000；3.大湖水殖股份有限公司，湖南省水產工程技術研究中心，湖南常德 415000)

中華鱉(Pelodiscussinensis)，屬爬行綱(Repitlia)龜鱉目(Testudinata)鱉科(Trionychidae)鱉屬(Pelodiscus)，是我國南方重要的養(yǎng)殖品種，尤以地理標志保護產品“漢壽甲魚”著名[1-2]。雄性中華鱉具有生長速度快、裙邊厚實、可食比例高的特點，為商品鱉養(yǎng)殖優(yōu)先選用；因種質資源退化和原生境破壞，雌性中華鱉為原良種保護和繁育所需[3-4]。因此，對于中華鱉的性別分化研究除了理論意義外[5～7]，還具有較大的生產實踐意義。

已有很多研究工作表明，在24～32 ℃孵化環(huán)境中，隨溫度升高，中華鱉雌性比率降低，雄性比率升高，胚胎的孵化率提高，孵化周期也就越短。中華鱉性別決定為溫度依賴型(temperature dependent sex determination, TSD)[8]，但也有研究指出中華鱉存在微小性染色ZW，屬于基因型性別決定機制(genetic sex determination, GSD)[9]。當前，中華鱉胚胎分化的研究重點在雄性化誘導，主要方法有3種：一是孵化溫度控制；二為性激素和化學物質誘導；三是溫度和激素集合處理[10～13]。這3種方法需人工操作，設施設備要求多，工作量大，效果不穩(wěn)定。目前，有關中華鱉胚胎的雌性化誘導工作報道極少，對除溫度、濕度外的其他環(huán)境因子影響中華鱉性別決定和性腺分化的報道也極少。

本研究擬采用物理手段(孵化基質、磁、聲、光等)影響中華鱉胚胎性別分化方向，試圖找到安全、有效、簡便的方法改變中華鱉孵化性比和提高孵化率，為中華鱉的人工繁育和種質資源保護工作提供理論與技術上的參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源和孵化環(huán)境

孵化實驗在湖南省漢壽縣特種水產科學研究所中華鱉良種場于2017年7月中旬-9月上旬進行。早上自親鱉池塘旁的產卵沙場中收集鱉卵(蛋)，挑選受精卵排列放置于孵化房子的塑料盆，待第二天孵化實驗用。

在4間18 m2蓋瓦單層紅磚房(3 m×6 m×3 m)內進行室內環(huán)境孵化，無加溫措施。實驗期每日上午與晚上各記錄一次空氣和基質中的溫度、濕度；整個夏季，孵化室內溫度在23～38 ℃，平均為28.7 ℃；空氣相對濕度在62%～82%，平均為75.7%；孵化基質含水量保持在在8%左右；孵化基質溫度在24～36 ℃，平均29.3 ℃。

1.2 實驗分組

實驗所用木箱(50 cm×40 cm×10 cm)底層均鋪設3 cm土壤，其中磁場處理組所用木箱底部內面固定了10塊扁平磁鐵(190 mm×70 mm×18 mm)，實驗磁場為非均勻性非電流靜磁場，鐵氧永磁體型磁鐵來自徐州市恒通磁鐵公司。受精卵(蛋)按動物極朝上間隔排列整齊后，覆蓋不同孵化基質(土壤或蛭石)。依據中華人民共和國國家標準《中國土壤分類與代碼》(GB/T 17296—2000)，實驗所用土壤種類為紅壤類(A13)典型紅壤亞類(A131)灰泥質紅壤屬(A13117)中的灰紅沙土(A1311712)，是發(fā)育于石灰?guī)r等碳酸巖類殘坡積物母質的土壤。土壤粒徑在0.05～0.02 mm；蛭石粒徑在 0.1～0.3 mm?；|含水量在6%～10%。每個木箱中受精卵總數(shù) 390～430個，受精卵間間距大約為0.5 mm。

實驗設計分為3組，每組處理和對照各設計3個平行：第1組和第2組為磁場N極處理組(CN)和磁場S極處理組(CS)，實驗組和對照組的基質均為土壤，兩組鱉卵位置的磁感應強度(高斯儀，SJL-1，南京山特儀器有限公司)平均為1.2 mT，作用時間為整個孵化期；第3組，蛭石基質處理組(Z)與土壤對照組的孵化基質分別為蛭石與土壤。

1.3 稚鱉雌雄分別(性別鑒別)方法

于11月份后對孵化后90～110日齡的中華鱉稚鱉采用3種方法進行性別鑒別，每個實驗組的樣品數(shù)不低于200個。方法1為第二性征觀察測量法，解剖鏡觀察尾部形態(tài)、泄殖孔的位置來判別，雄性稚鱉尾長、呈錐形，且超出裙邊，泄殖腔孔近尾中部；雌性稚鱉尾寬短，未超出裙邊，末端驟然變細且呈結節(jié)狀，泄殖腔孔近尾基部[14]；方法2為第二性征觀察測量法，解剖鏡觀察泄殖腔(泄殖孔)中有無陰莖、陰莖大小和黑斑(陰莖退化痕跡)來判別[13]； 方法3為顯微解剖觀察法，體視鏡觀察性腺形態(tài)與大小、有無輸卵管來判別雌雄[15～17]。然后，依據上述方法分別的雌雄個體，全部取性腺部分固定或直接包埋，進行冰凍切片(Leica CM1950，德國萊卡公司)、蘇木精-伊紅組織染色(H.E stain)，顯微鏡(Nikon E100，日本尼康公司)觀察精原細胞或卵原細胞、輸卵管或輸精管的特征來判別雌雄[15,16,18]，并計算雌性個體或雄性個體中的辨別正確率(%)。

使用精度為0.02 mm的數(shù)顯游標卡尺(Mitutoyo CD-20AX, 日本)測量稚鱉第二性征器官的長度和直徑。

1.4 數(shù)據統(tǒng)計方法

數(shù)據描述采用平均數(shù)(Mean)或平均值±標準差(Mean±SD)。實驗組中孵化率和孵化性比的顯著性分析采用SPSS 22.0進行獨立樣本T檢驗。

2 結果

2.1 中華鱉雄性與雌性稚鱉的第二性征和第一性征特點

剖開泄殖腔后可以明顯地看到雌性稚鱉的陰莖可見、細小，黑斑凸起(圖Ⅰ-1)。雄性稚鱉的陰莖明顯、粗壯，棒狀，陰莖龜頭深褐色，腹面白色(圖Ⅰ-2)。在粗壯和細小之間，一部分個體處于過渡大小。

從圖Ⅰ-3、Ⅰ-4可見，稚鱉有左右對稱的生殖腺，位于體后腹腔背面脊柱的兩側、腎臟(K)內側；腎上腺(A)線狀梭形，黃色。雌性個體的卵巢(O)為梭形，大小與同齡個體的精巢相當，表面不平滑，有系膜與腹腔相連；輸卵管(OV)位于腎臟另一側，白色管線狀，不與卵巢相連，開口于卵巢的前方體腔，沿卵巢外緣下行，后端彎曲通入泄殖腔(圖Ⅰ-3)。雄性個體的精巢(T)為乳白色，中央粗，兩端細，表面光滑，外形規(guī)則；輸精管不明顯或難以觀察到(圖Ⅰ-4)。

在稚鱉性腺的組織切片中，輸卵管(OV)明顯可見(圖Ⅰ-5)，而輸精管難以觀察到(圖Ⅰ-6)。卵巢中，觀察有卵原細胞(OO)和早期的初級卵泡(PO)，初級卵泡多集中在皮質部分(圖Ⅰ-7)。卵原細胞直徑大約2～6 μm，周圍沒有濾泡細胞(FC)；初級卵泡直徑約為 30～60 μm，周圍有少量的濾泡細胞，沒有空泡出現(xiàn)(圖Ⅰ-9)。精巢中，曲細精管(ST)開始形成，管腔不明顯，內有精原細胞(SP)(圖Ⅰ-8)；除了結締組織基質和間質細胞(IC)以外，精原細胞分布散、數(shù)量較多，多集中于髓質(圖Ⅰ-10)。

2.2 不同孵化條件下中華鱉的孵化情況

本實驗在夏季室內自然條件下進行，各實驗組中華鱉孵化期在43～47 d。從表1可見，蛭石基質中的中華鱉孵化率顯著高于土壤介質(P<0.05)，平均為90.4%，比土壤介質組高出8.3個百分點。磁場N級處理與S級處理都極顯著影響中華鱉的孵化率(P<0.01)，分別平均為51.0%與49.8%，比對照組分布降低28.9個百分點和31.7個百分點。

4.仔豬水腫。新生仔豬常因皮下水腫或漿 液過多造成死亡，可能是溶血性大腸桿菌所致或因缺碘、血液中蛋白質過低而引起的。

表1 不同孵化條件下中華鱉的孵化率

注：*T檢驗差異顯著(P<0.05)；**T檢驗差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 不同孵化條件下中華鱉的孵化性比情況

在依據方法1和方法2判別雌雄進行測量的樣品中，雄性稚鱉的尾長在5.04～6.12 mm，泄殖腔孔距離尾基部長度為2.76～4.02 mm，尾端超出裙邊的長度在0.70～1.92 mm；雌性稚鱉的尾長在4.54～5.52 mm，泄殖腔孔距離尾基部長度為2.80～3.50 mm，尾端離裙邊的長度為0.58～1.56 mm。雄性稚鱉的陰莖直徑在0.76～1.10 mm，自基部長度為2.56～3.04 mm，明顯可見合攏的深褐色龜頭(圖2)；雌性稚鱉中可見退化的陰莖殘跡(圖1)，其直徑0.44～0.52 mm，自基部長度為1.50 mm 以下。

從表2可見，采用觀察第二性征為主的方法1、方法2計算的雌性占比與方法3得到的結果明顯不同，在高于或低于對照組數(shù)據上有的方向相反，且沒有規(guī)律。采用解剖觀察第一性征(輸卵管有無)為主的方法3辨別出的雌雄個體，進行了冰凍切片后觀察精原細胞或卵原細胞的驗證，方法3得到的每組雌性占比數(shù)據的準確率為100%。

磁場N極和S極處理可以顯著提高中華鱉孵化的雌性占比(P<0.01)，分別平均為69.5%和68.3%，比對照組提高11.0個百分點和11.5個百分點；磁場N極和S極處理組間沒有顯著性差異(P>0.05)。土壤基質中孵化后雌性占比為56.6%，顯著高于蛭石介質的48.2%(P<0.05)，提高8.4個百分點。土壤基質中雌性占比在56.6%～58.5%，比蛭石介質組有雌性占比較高的現(xiàn)象。

表2 不同孵化條件下中華鱉孵化后雌性占比情況

3 分析與討論

3.1 中華鱉稚鱉的雌雄判別方法比較

一般把夏秋季已出殼到第二年越冬后的中華鱉，稱為稚鱉；稚鱉的雌雄鑒定在性別分化研究中有關鍵地位，直接影響實驗結果和效果的分析和判斷。已有一些研究從外部形態(tài)學和第二性征解剖觀察來判定中華鱉雌雄，如朱道玉[14]從尾部形態(tài)和泄殖孔位置，李慧君[17]和唐瑤[13]從外生殖器的明顯與退化形態(tài)還有唐瑤[13]從殼長、殼寬、尾長、裙邊寬等數(shù)量特征的統(tǒng)計分析。本實驗結果中，中華鱉稚鱉第二性征的數(shù)量差異在毫米級別，測量范圍間的基點難以分辨，達到測量基點固定和清晰的程度，受實驗觀察者主觀影響。所以，用上述方法來分辨稚鱉雌雄的結果很難做到準確和有效，依此做出的結論可靠性也不高。

對通過輸卵管的存在與否，計數(shù)雌雄個體的結果是準確的，并進行組織切片驗證。孵化出殼后到180日齡稚鱉，卵巢類卵泡已經發(fā)育到初級卵泡期，曲細精管開始形成但不明晰[20]。所以說，解剖后體視顯微鏡或肉眼觀察，依據腎臟旁白色細線狀輸卵管的存在與否和與精巢相連的輸精管并不明顯或不可見，可以正確判別稚鱉雌雄。這個結論與朱道玉[19]、葉玉珍等[20]、余文萍[11]的研究結果相一致。

3.2 孵化基質對中華鱉孵化率和孵化性比的影響

在中華鱉胚胎雄性化誘導方面，使用溫度、激素、其他化學物進行處理可以實現(xiàn)[10～12]，但有關雌性化誘導的方法和措施鮮有報道。已有研究認為，通過溫度影響睪酮芳香化酶和睪酮5α-還原酶的活性控制雌、雄激素轉化，進而決定了個體的性別分化[9,12]；Sf1、Wt1、Sox9、Dmrt1、Dax1等基因參與了龜鱉類性別分化[23]。本實驗中，土壤基質中孵化后中華鱉雌性比率達到56.6%，顯著高于蛭石介質中的48.2%。由于孵化基質影響中華鱉或龜鱉類動物的雌雄性比或性別分化研究極少，所以其生理生化或分子機理也無從推測，有待更多、更深入的實驗研究。

3.3 磁場對中華鱉孵化率與孵化性比的影響

磁技術具有無污染、無殘毒、效果好、低成本的特點，是一種無公害處理新技術；磁場分為靜磁場(穩(wěn)恒磁場)和動磁場(變化磁場)，實驗所用鐵氧磁鐵為非均勻性非電流靜磁場類型之一。目前，生物磁學的研究工作主要集中在植物種子萌發(fā)與生根、微生物代謝、腫瘤細胞抑制、動物細胞粘附、細胞周期變化、細胞骨架變化等[24,25]；磁場生物作用機制的探討是一個復雜而艱難的過程，推測認為與胞內鈣離子信號通路或其他細胞膜受體蛋白帶電分子有關[26]，與磁場中帶電元素運動受到的洛倫茲力有關[24]，與酶結構中金屬原子的順磁性、酶蛋白的半導體性、酶分子構象及電荷傳遞變化有關[27,28]。

有關水產動物的磁場效應實驗有一些報道。磁感應強度(0.07 T)和磁化水(0.05～0.7 T)處理可提高金魚孵化率16%～31%，魚苗生長速度增加30%～40%[29]；養(yǎng)殖奧利亞羅非魚(Tilapiaaureas)可促進其生長，并增強其耐寒力[30]；磁場處理(0.2～0.7 T)后磁化水養(yǎng)殖草魚和鯉魚，草魚的紅細胞、白細胞、血紅蛋白數(shù)量會有降低，鯉的紅細胞溶血率會減弱或增強[31]；恒定電磁場(0～2.0 mT)下養(yǎng)殖100 g左右鯽魚，血清中堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、溶菌酶的活性和蛋白含量明顯受到抑制或減低，造成不利影響[32]。但是，目前磁場處理對龜鱉孵化效應的研究鮮有報道。

無論是磁場N極處理、還是S極處理，都顯著降低中華鱉的孵化率，平均僅為49.8%～ 50.1%，比對照組降低28.9～31.7個百分點，可以認為出現(xiàn)致死現(xiàn)象。雖然本實驗中為弱磁場處理(磁感應強度為1.2 mT)，但作用時間為中華鱉整個孵化期(45 d左右)，孵化過程中長時間受磁場作用是否會產生不利影響，還有待下一步實驗研究。從孵化后個體雌性占比數(shù)據來看，磁場處理明顯導致了胚胎雌性化誘導效果，磁場方向(N極、S極)并沒有影響中華鱉的孵化后雌性占比(68.3%～69.5%)，比對照組提高11～11.5個百分點。Vanag 等[27]實驗發(fā)現(xiàn)1～10 mT的磁場可影響動物細胞內酶的活性，改變其生化反應速度。磁場是否促進生成雌激素的睪酮芳香化酶的活性，或抑制生成雄激素的睪酮5α-還原酶的活性，是從生理生化水平探討磁場導致中華鱉胚胎雌性化誘導機制的路徑之一。磁場參數(shù)(類型、方向、強弱、均勻性、作用時間)和細胞因子(磁性、種類、敏感性、作用部位)是影響細胞生物學磁效應的因素[24]，對于磁場誘導中華鱉胚胎雌性化的現(xiàn)象和機理，還需更多的實驗研究來探討。

圖版Ⅰ：中華鱉雌雄幼鱉的生殖器官形態(tài)與性腺組組學比較Plate Ⅰ：Comparison of reproductive organs morphology and gonads histology between female and male juvenile soft-shelled turtles,Pelodiscus sinensis圖1、2 中華鱉稚鱉外生殖器(線條指示1 mm);圖3、4 中華鱉稚鱉性腺解剖 (線條指示2 mm) ;圖5、6 中華鱉幼鱉性腺切片觀察(線條指示100 μm) ;圖7、8 中華鱉幼鱉性腺切片觀察(線條指示50 μm);圖9、10 中華鱉幼鱉性腺切片觀察(線條指示20 μm)圖標說明：A：腎上腺；FC：濾泡細胞；FJT：雌性稚鱉生殖器；IC：間質細胞；K：腎臟；MJT：雄性稚鱉生殖器；O：卵巢；OO：卵原細胞；OV：輸卵管； PO：初級卵泡；SP：精原細胞；ST：曲精小管；T：精巢。