基于線粒體COI基因序列的蒙古鲌群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

謝佳燕，顏 淵，楊鈺慧，林少卿

(1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023；2.西藏自治區(qū)畜牧總站水產(chǎn)科，拉薩 850007)

蒙古鲌(Chanodichthysmongolicus)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)，為兇猛肉食性魚類。廣泛分布于我國(guó)的江河、湖泊、水庫(kù)等各種水體，是長(zhǎng)江流域中重要的經(jīng)濟(jì)魚類[1-2]。蒙古鲌?jiān)情L(zhǎng)江中下游湖泊魚類群落的優(yōu)勢(shì)物種和漁業(yè)生產(chǎn)的主要對(duì)象[1]。然而, 由于過(guò)度捕撈、生境破壞和水污染等原因, 天然水域中蒙古鲌資源嚴(yán)重衰退，分布區(qū)域縮小[3]。為彌補(bǔ)天然資源的不足和滿足市場(chǎng)需求，近年來(lái)長(zhǎng)江中下游一些湖泊已開(kāi)始實(shí)施蒙古鲌人工增殖放流和人工繁殖的研究[4-5]。對(duì)放流群體進(jìn)行監(jiān)測(cè)后發(fā)現(xiàn)蒙古鲌生長(zhǎng)速度較快, 放流次年可長(zhǎng)至500 g以上的商品魚, 是湖泊增殖放流的優(yōu)良品種[5]。然而，在人工繁殖的實(shí)踐中，規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖的首要問(wèn)題是解決苗種來(lái)源。因此，對(duì)物種天然種群進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定和遺傳組成的分析，對(duì)于合理利用物種種質(zhì)資源及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整具有重要的實(shí)踐意義。

線粒體COI(cytochrome oxidase subunit I)基因?yàn)槲挥诰€粒體DNA的蛋白質(zhì)編碼基因，已廣泛應(yīng)用于物種鑒定和群體遺傳學(xué)等方面的研究[6-8]。彭居俐等[6]用COI基因序列探討了鲌屬魚類物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。王丹等[7]揭示了三峽庫(kù)區(qū)鲌屬魚類具有較高的線粒體COI基因序列遺傳多樣性。目前, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蒙古鲌的生物學(xué)特性、遺傳組成、人工繁殖技術(shù)和營(yíng)養(yǎng)成分等方面已進(jìn)行了相應(yīng)的研究[2,4,6-9]，但對(duì)蒙古鲌自然種群間遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析方面的研究較少。因此，本研究對(duì)我國(guó)長(zhǎng)江中下游流域湖北段和江蘇段不同河段或湖泊中的蒙古鲌種群進(jìn)行COI基因序列測(cè)序，分析不同水域蒙古鲌種群的遺傳組成和遺傳關(guān)系，以期為長(zhǎng)江流域蒙古鲌自然種質(zhì)資源現(xiàn)狀的評(píng)價(jià)、保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

蒙古鲌樣本分別采自于湖北省丹江口市丹江口水庫(kù)(DJ) 、湖北省荊門市漳河鎮(zhèn)漳河(JM) 、武漢市磨山東湖(DH) 、武漢市安山鎮(zhèn)梁子湖(LZH) 和江蘇省丹陽(yáng)市(JS)。取新鮮肌肉樣于95%乙醇中固定，-20 ℃保存。

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定

采用標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿法提取蒙古鲌基因組DNA[10]，利用Ward等[11]的引物FishF1/FishR2擴(kuò)增COI基因序列。PCR擴(kuò)增體系為30L，包括1.5 U的Taq DNA聚合酶和1L 的DNA模板。擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)由94 ℃ 50 s,52 ℃ 1 min,72 ℃ 1.5 min組成。之后72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束。產(chǎn)物送測(cè)序公司完成測(cè)序工作。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用ClustalX 1.83[12]和Seaview[13]軟件進(jìn)行COI基因片段核苷酸組成和序列分析。用DnaSP v5[14]軟件計(jì)算群體單倍型，Arlequin 3.5[15]進(jìn)行遺傳多樣性、群體的分子方差分析(Analysis of molecular variance, AMOVA)、遺傳距離和基因流Nm值的計(jì)算。使用Network 軟件基于Median Joining方法構(gòu)建單倍型之間的系統(tǒng)關(guān)系圖[16]。從NCBI下載鯉屬鯉(Cyprinuscarpio，序列號(hào)KJ511883)和海南鲌(C.recurviceps，序列號(hào)KJ609181)的線粒體DNA全長(zhǎng)序列，與蒙古鲌個(gè)體的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，識(shí)別COI基因序列并進(jìn)行比較分析。在MEGA 6.0軟件[17]中以Kimura雙參數(shù)法(Kimura-2-parameter)為替代模型，采用NJ法(Neighbour-joining)構(gòu)建蒙古鲌不同種群的分子聚類樹，分支置信度采用自引導(dǎo)法(Bootstrap analysis) l 000次重復(fù)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 蒙古鲌COI基因片段核苷酸組成特點(diǎn)

對(duì)蒙古鲌樣本的線粒體COI基因序列進(jìn)行比對(duì)，獲得COI基因其5′端長(zhǎng)度為652 bp的同源序列。其中，多態(tài)位點(diǎn)9個(gè)，無(wú)堿基插入或缺失，7個(gè)位點(diǎn)為堿基轉(zhuǎn)換，2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基顛換，但翻譯后所有氨基酸組成均相同，表明COI基因的編碼在蒙古鲌魚種中的保守性。序列中(A+T)堿基的含量為0.524高于(G+C)的含量0.475，但堿基組成在蒙古鲌不同種群間無(wú)顯著差異。

2.2 蒙古鲌COI基因序列的單倍型分析

蒙古鲌不同地理種群個(gè)體的COI基因序列共定義了10種單倍型，各單倍型在各地理種群間的分布見(jiàn)表1。6種單倍型為單個(gè)蒙古鲌種群所特有, 占個(gè)體總數(shù)的13.2%，另外的4種單倍型在不同種群間共享。其中，單倍型h9分布最廣，在蒙古鲌所有群體中均有分布，其個(gè)體數(shù)占總數(shù)的54.7%。種群間單倍型數(shù)最多是東湖種群(DH)為6種，荊門種群(JM)最少僅有1種。對(duì)蒙古鲌種群的單倍型進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖分析(圖1)。結(jié)果表明，所有單倍型以種群?jiǎn)伪缎?為中心和起點(diǎn)，其他單倍型則經(jīng)過(guò)1～2步突變與其相連，其他單倍型呈星狀分布態(tài)勢(shì)或進(jìn)化形成新的分支。各單倍型之間的突變步數(shù)為1～2步，各單倍型并未依據(jù)采樣地而形成各自的分支。

表1 蒙古鲌不同種群COI基因序列的單倍型分布

2.3 不同蒙古鲌種群的遺傳多樣性

對(duì)蒙古鲌不同地理種群的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)(表2)。結(jié)果表明，蒙古鲌總?cè)后w的基因多態(tài)性(H)為0.664，核苷酸多態(tài)性()為0.002。不同種群間遺傳多樣性存在一定差異，其中，江蘇(JS)和梁子湖(LZH)種群間的基因多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性較高，而荊門(JM)種群僅有一種單倍型，遺傳多樣性指數(shù)值為零。

圖1 蒙古鲌不同種群線粒體COI基因的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

表2 蒙古鲌種群的基因多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性

2.4 蒙古鲌的種群結(jié)構(gòu)與遺傳差異

對(duì)蒙古鲌不同種群之間的遺傳距離進(jìn)行檢測(cè)(表3)。結(jié)果表明，種群間的遺傳距離在-0.076～0.383之間，除DJ群體與其他群體間的遺傳距離存在顯著差異(P<0.05)外，其余的群體間無(wú)明顯差異，種群間存在一定的基因流，整個(gè)野生種群的基因流值為7.841。對(duì)蒙古鲌不同種群進(jìn)行分子變異分析(AMOVA)表明，遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，占整個(gè)種群的79.7%。根據(jù)群體間遺傳距離的結(jié)果，將所有種群分為兩組(DJ群體組和其他個(gè)體組)進(jìn)行分子變異分析。結(jié)果表明，不同組間遺傳變異為30.1%，組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。

基于Kimura雙參數(shù)法，計(jì)算不同蒙古鲌種群間的遺傳距離，以鯉屬鯉(Cyprinuscarpio，序列號(hào)KP993137)的線粒體DNA序列作為外群，構(gòu)建NJ聚類樹(圖2)。結(jié)果表明，蒙古鲌種群個(gè)體呈現(xiàn)一種混雜的分布格局, 未檢測(cè)到與采樣地點(diǎn)嚴(yán)格對(duì)應(yīng)的分支, 不能依據(jù)地理區(qū)系進(jìn)行分群。

表3 不同蒙古鲌種群間的遺傳距離

注：*為群體間的遺傳距離存在顯著差異，P<0.05

3 討論

本研究中長(zhǎng)江中下游流域湖北段和江蘇段不同河段或湖泊中的蒙古鲌自然種群的遺傳多樣性水平中等，不同種群間遺傳多樣性存在一定差異。單個(gè)種群特有的單倍型較少，較多個(gè)體屬于共享單倍型。這可能與近年來(lái)長(zhǎng)江中下游流域生境破壞、過(guò)度捕撈和水污染等致使天然水域中蒙古鲌資源嚴(yán)重衰退有關(guān)[3]。

圖2 蒙古鲌線粒體COI基因序列單倍型的NJ聚類樹

種群分子方差分析表明了蒙古鲌不同野生種群間顯示出一定程度的遺傳不同。地理隔離、棲息地差異、遷移、人類活動(dòng)等因素均可能導(dǎo)致群體間遺傳差異的出現(xiàn)[18-20]。一些湖泊群體歷史上與長(zhǎng)江干流連通，近年來(lái)與干流處于相對(duì)可控連通的狀態(tài)[21-22]，可能促進(jìn)了棲息地間的不連續(xù)性和地理隔離。同時(shí)，蒙古鲌繁殖時(shí)所產(chǎn)卵具一定黏性，而棲息于江河流水或水庫(kù)上游環(huán)境中的個(gè)體可產(chǎn)漂流性卵[23]，但水體間長(zhǎng)距離遷移的削弱，可能加速了由于地理距離導(dǎo)致的遺傳變異的產(chǎn)生。此外，棲息地水體環(huán)境污染日益嚴(yán)重，梯級(jí)水利設(shè)施的大規(guī)模構(gòu)建和過(guò)度捕撈等，也可能促進(jìn)了種群間的遺傳差異[24-25]。漢江為長(zhǎng)江最大支流，于長(zhǎng)江中游武漢段匯入長(zhǎng)江。丹江口群體位于漢江上游，地理位置上的不同可削弱支流上游群體與干流上中游群體間的遷移和基因交流；此外，20世紀(jì)70年代建成了丹江口大壩。大壩隔離和構(gòu)建后水力學(xué)條件的顯著變化也可削弱支流上游群體向干流群體的遷移，從而可促進(jìn)其遺傳差異的產(chǎn)生和固定。一些研究也發(fā)現(xiàn)丹江口大壩建成后漢江中下游經(jīng)濟(jì)魚類的早期資源發(fā)生明顯的變化，經(jīng)濟(jì)魚類卵苗徑流量明顯下降，產(chǎn)卵場(chǎng)數(shù)量減少[24-25]。

雖然不同蒙古鲌種群間顯示了一定程度的遺傳差異，但聚類樹也揭示了蒙古鲌不同種群個(gè)體仍然呈現(xiàn)一種混雜的分布格局，無(wú)法依據(jù)地理區(qū)系進(jìn)行分群，未形成明顯的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu), 表明蒙古鲌種群可能正處于譜系重排時(shí)期。分子方差分析也表明雖然丹江口群體與其他群體間存在明顯差異，但分組分析并未表明丹江口群體可完全解釋組間變異的產(chǎn)生。兩個(gè)因素可能導(dǎo)致物種種群處于譜系重排狀態(tài)，即種群間的隔離分化較短及種群間基因交流[26]。鲌屬魚類是東亞特有鯉科魚類中較為重要的一個(gè)類群[1]，研究認(rèn)為鲌屬魚類經(jīng)歷了相同的短時(shí)間物種暴發(fā)，因此作為一群快速分化的物種，其基因序列的變異度相對(duì)較小[27]。此外，遺傳距離分析也表明大部分的群體間無(wú)顯著的遺傳差異，不同種群間仍然存在一定的基因交流；棲息地水系間相互連通，也促進(jìn)了種群間相互交流，共享單倍型，削弱因地理距離產(chǎn)生的種群間差異，致使不同種群間缺乏較為明顯的按地理單元?jiǎng)澐值牡乩矸植几窬帧?/p>