超聲微泡聯(lián)合干細(xì)胞移植對心肌梗死大鼠心肌微環(huán)境的影響及循環(huán)Irisin水平的相關(guān)性研究

薛靜，張周龍，陳勝江

心肌梗死（MI）是目前世界范圍內(nèi)致死及致殘的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)超聲靶向破壞微泡（UTMD）已經(jīng)發(fā)展成為用于位點(diǎn)特異性藥物和基因遞送的新的有前景的工具，其具備優(yōu)良的毛細(xì)血管通透性，能無創(chuàng)性地和選擇性地將基因遞送至梗塞部位[1-3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有經(jīng)血液循環(huán)歸巢至損傷心肌的能力，但目前缺乏促使干細(xì)胞向缺血心肌特異性趨化的有效方法，若單純的通過干細(xì)胞在損傷區(qū)的歸巢能力來進(jìn)行治療，相應(yīng)的療效一般不很好[4]。本文主要是對超聲破壞微泡聯(lián)合MSCs移植進(jìn)行心肌細(xì)胞修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究，探討其是否可促進(jìn)心肌梗死大鼠血管新生，并分析VEGF和Irisin的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 一般材料10只Wistar大鼠（2周齡），體重（25±5）g，用于分離與培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，60只成年Wistar健康大鼠，體重（219±21）g，用于心肌梗死模型構(gòu)建，以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不限定雌雄，購于河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。聲諾維（Sonovue）超聲造影劑，購于意大利博萊科公司。心臟彩超機(jī)，型號(hào)IE33，荷蘭Philips公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng)幼齡大鼠取脛骨及股骨的骨髓液，采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)技術(shù)來分離、純化與培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs，得到符合心肌梗死移植的種子細(xì)胞。

1.2.2 動(dòng)物模型制作Wistar 大鼠以10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉后, 連接心電監(jiān)護(hù)儀，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái), 頸胸部備皮，行氣管插管呼吸機(jī)輔助通氣，打開胸腔 , 暴露心臟 , 找準(zhǔn)左心耳，在與肺動(dòng)脈圓錐交界處下方約2 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，控制3～5 mm左右的進(jìn)針深度，觀察心電圖R波增寬、ST段和J點(diǎn)持續(xù)抬高為模型制作成功標(biāo)志。術(shù)后常規(guī)關(guān)胸，腹腔注射青霉素抗感染8萬 U/只 ，1/d，連續(xù)3 d 。

1.2.3 分組與處理將40只MI模型制備成功的Wistar大鼠隨機(jī)分為4組：A：超聲微泡+MSCs組（US/MB+MSCs）；B：單純 MSCs 組（MSCs）；C：超聲微泡組（US/MB）；D：空白對照組（C）。心梗模型制成后第2 d A組和C組經(jīng)尾靜脈注入聲諾維超聲微泡溶液1 ml（濃度約2×108個(gè)/ml），同時(shí)經(jīng)胸診斷超聲輻照，頻率為 5MHz，機(jī)械指數(shù)（MI）1.3，輻照5 s，間隔5 s，共10 min，第4 d及第6 d重復(fù)超聲輻照微泡操作，共輻照3次，待完成建模第7 d，D組經(jīng)尾靜脈注入1 ml生理鹽水作為對照；A組和B組經(jīng)尾靜脈注入干細(xì)胞懸液（1×107個(gè)細(xì)胞混懸于2 ml PBS中）于2 min內(nèi)緩慢注入。

1.2.4 病理學(xué)檢測及蛋白水平檢測分別于心肌梗死模型建立時(shí)取不同時(shí)間段及治療后28 d經(jīng)尾靜脈抽取大鼠靜脈血，采用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附）法用于Irisin水平檢測，處死大鼠后，取梗死邊緣心肌組織，借助免疫組織化學(xué)（IHC）染色技術(shù)對CD34及VEGF表達(dá)水平進(jìn)行檢測，計(jì)數(shù)微血管密度（MVD）；借助Western Blot與ELISA對VEGF蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩對比。采用線性相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌梗死后血清Irisin 表達(dá)水平與對照組相比，MI大鼠血清Irisin水平從1 h逐漸下降至24 h，最低值為1 h約（412.1±25.5 ）ng/ml，2 h后再次略有增加（427.5±28.6 ）ng/ml?？傮w而言，與對照相比，MI構(gòu)建后Irisin水平顯著降低（P＜0.05）（圖1）。

圖1 MI大鼠血清Irisin水平

圖2 各組大鼠CD34免疫組化圖片（×400）

圖3 各組大鼠VEGF免疫組化圖片（×400）

表1 各組心肌組織微血管計(jì)數(shù)（個(gè)/HP）

2.2 免疫組化檢測A組的心肌組織內(nèi)有大量的CD34和VEGF陽性顆粒表達(dá)，顯示為棕黃色或棕褐色顆粒（圖2～3）， CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿或胞膜，以CD34為標(biāo)記，在顯微鏡每高倍鏡視野下計(jì)數(shù)微血管數(shù)量，結(jié)果顯示A組新生血管最多， D組最少，差異具有顯著性（P＜0.05，表1）。

2.3 ELISA法檢測心肌VEGF及血清Irisin含量治療后心肌組織VEGF含量檢測結(jié)果示A組含量最高，為（3.23±0.21）ng/g，與其他組相比存在顯著差異（P＜0.05），Irisin含量A組最高，為（607.4±35.6）ng/ml（P＜0.05）（圖4）。

2.4 Western Blot檢測結(jié)果通過Western Blot檢測，發(fā)現(xiàn)A組的VEGF條帶最明顯，同樣A組的Irisin條帶也最明顯，用Quantity Qne軟件定量分析了各組蛋白的表達(dá)，顯示A組的VEGF及Irisin蛋白表達(dá)明顯高于其他各組（P均＜0.05）（圖5）。

2.5 心肌VEGF和血清Irisin水平相關(guān)性分析心肌VEGF和血清Irisin水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.902（圖6）。

圖4 ELISA法測得各組MI大鼠VEGF和血清Irisin的含量

圖5 Western Blot測得各組MI大鼠中VEGF和Irisin蛋白的表達(dá)

3 討論

圖6 心肌VEGF和血清Irisin線性相關(guān)散點(diǎn)圖

急性心肌梗死后很容易引發(fā)心肌細(xì)胞死亡，目前臨床上治療AMI存在相應(yīng)的局限性，無法徹底恢復(fù)心肌供血。血管新生是心肌缺血的一種血運(yùn)重建[5]。根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)可得，成熟的臟器已經(jīng)建成的血管內(nèi)，炎性反應(yīng)和損傷等很容易刺激內(nèi)皮細(xì)胞，且可起到誘導(dǎo)血管新生的效果。

大量研究結(jié)果表明，超聲引發(fā)微泡造影劑破損，引發(fā)的生物學(xué)效應(yīng)，可以使微血管發(fā)生破裂，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增加了血管生長因子的表達(dá)水平，促進(jìn)血管新生，并且能夠靶向作用于器官或細(xì)胞，定位釋放藥物或基因，從而實(shí)現(xiàn)靶向治療[6-8]。骨髓 MSCs移植在一定程度上能改善心功能，具有取材方便、不涉及倫理道德問題等優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。已有文獻(xiàn)報(bào)道，MSCs可能是通過血管再生[9,10]、分泌細(xì)胞因子[11,12]及抑制心室重構(gòu)[13]來改善心功能。但目前缺乏促使干細(xì)胞向缺血心肌特異性趨化的有效方法，因此，提高移植的干細(xì)胞向心肌缺血受損區(qū)的靶向歸巢能力及增加其在靶區(qū)的存活率是目前亟待解決的問題。

部分學(xué)者提出，急性心肌梗死時(shí)損傷局部的VEGF因子其表達(dá)水平也在提高[14]，從而起到調(diào)節(jié)干細(xì)胞歸巢的作用，為增強(qiáng)缺血局部的心肌梗死打下良好的基礎(chǔ)。根據(jù)以上論述可推斷，急性心肌梗死時(shí)，損傷部位其環(huán)境改變，黏附分子與趨化因子表達(dá)的提升，會(huì)促進(jìn)循環(huán)血中干細(xì)胞聚集到受損心肌中[15]。Kamihata等研究表明[16]，移植細(xì)胞可以分泌很多類的細(xì)胞生長因子，主要如VEGF和轉(zhuǎn)化生長因子等，這些為相應(yīng)細(xì)胞的增殖和分化起到了一定的促進(jìn)作用，同時(shí)為組織細(xì)胞的再生提供了基礎(chǔ)。移植細(xì)胞分泌的生長因子可以起到相應(yīng)誘導(dǎo)血管形成的效果，有利于促進(jìn)側(cè)支循環(huán)，為血管系統(tǒng)的增殖提供了良好的條件[17]。本研究結(jié)果初步表明超聲破壞微泡聯(lián)合MSCs移植可有效促進(jìn)VEGF表達(dá)上調(diào)，心肌梗死后血管密度增加。本研究通過ELISA及Western Blot測定來確定VEGF的表達(dá)，在A組中觀察到約3.5倍的VEGF蛋白表達(dá)，A組心肌VEGF含量明顯高于其他各組（P＜0.05）。

Irisin是一種肌肉因子，可從纖連蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域蛋白5（FNDC5）中進(jìn)行蛋白水解切割和分泌[18]。最近的研究發(fā)現(xiàn)Irisin主要在心肌內(nèi)產(chǎn)生。Irisin是一種新的解偶聯(lián)thermogenin肽，可以耗盡ATP并增加產(chǎn)熱[19]。ATP對于肌細(xì)胞活力和正常心臟功能，包括肌原纖維收縮和離子轉(zhuǎn)運(yùn)是必不可少的[20]。由于肌酸激酶（CK）導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生減少，ATP和磷酸肌酸在人類心肌梗死中減少，是由于心肌細(xì)胞丟失引起的底物耗竭[20]。有研究表明血清Irisin的表達(dá)水平與心臟冠狀動(dòng)脈的病變程度呈負(fù)相關(guān)[21]，因此，Irisin可以用作一種心肌梗死的診斷性生物標(biāo)志物[22]。我們研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，心肌梗死構(gòu)建后Irisin水平顯著降低（P＜0.05），說明Irisin在心肌梗死大鼠中被抑制（圖1）。整體趨勢與Kuloglu等[22]一致，表明心肌梗死大鼠模型成功建立。并且，觀察到在UTMD聯(lián)合MSCs能夠明顯恢復(fù)Irisin的表達(dá)（P＜0.05），然而，關(guān)于血清Irisin水平，與D組（424.9±28.9）ng/ml相比，A組血清Irisin（607.4 ±35.6）ng / mL只有1.4倍。 這可能是由于Irisin在各種組織中表達(dá)，包括心臟和骨骼肌，肝臟，腎臟，外周神經(jīng)鞘和血清等[23]。所以，確定所有表達(dá)Irisin的組織是我們進(jìn)一步關(guān)注的問題之一。另外我們對心肌VEGF和血清Irisin水平進(jìn)行了相關(guān)性分析，顯示VEGF和Irisin呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.902，這也間接說明了UTMD聯(lián)合MSCs能逆轉(zhuǎn)梗死心肌，改善心肌存活。