動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中TNF-α的表達(dá)與斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系

劉清霞，張宏穎，徐利霞，姜輝，韓新生

隨著人口老齡化的發(fā)展，心腦血管疾病已成為威脅人們生命健康的主要疾病，其發(fā)病率和死亡率常年居高不下[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈硬化血管病中最常見的一種，也是引起嚴(yán)重心腦血管疾病的主要原因之一，其真正的病因及發(fā)病機(jī)制目前仍不明確[2]。醫(yī)學(xué)研究表明[3]，動(dòng)脈粥樣硬化的基本病變?yōu)橹|(zhì)在動(dòng)脈血管內(nèi)膜進(jìn)行沉積，引發(fā)血管內(nèi)膜發(fā)生灶狀纖維化改變，使動(dòng)脈彈性降低，出現(xiàn)粥樣斑塊，造成動(dòng)脈管腔變窄，管壁增厚變硬，從而引發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。?、腦梗塞等心腦血管疾病，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患者死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年平均超過1900萬人突發(fā)急性心腦血管疾病死亡，在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，由動(dòng)脈粥樣硬化為主引起的心腦血管疾病死亡率已經(jīng)超過癌癥。長(zhǎng)久以來，動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防與治療一直被醫(yī)學(xué)界所重視。腫瘤壞死因子α（TNF-α）是介導(dǎo)人體免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)的重要炎性細(xì)胞因子，主要由活化的單核巨噬細(xì)胞分泌，與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[4]。本研究為了分析動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中TNF-α的表達(dá)與斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系，特對(duì)鄭州市第二人民醫(yī)院收治的80例患者進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2014年2月至2017年3月于鄭州市第二人民醫(yī)院行手術(shù)治療的冠狀動(dòng)脈（冠脈）粥樣硬化患者80例，其中冠脈支架植入術(shù)12例，冠脈血栓抽吸術(shù)17例，起搏器置入術(shù)15例，射頻消融術(shù)11例，先心病室間隔缺損10例、房間隔缺損封堵術(shù)15例，術(shù)中均獲取患者冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊標(biāo)本（部分斑塊），其中男性63例，女性17例；年齡45～82（58.7±2.5）歲，病程2～7年，平均病程（4.1±1.5）年。本組所有患者均經(jīng)過X線、超聲以及動(dòng)脈造影診斷為動(dòng)脈粥樣硬化。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者；②存在嚴(yán)重肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病以及惡性腫瘤患者；③患者臨床資料不全；④不愿接受調(diào)查及臨床試驗(yàn)者。

1.2 主要儀器與試劑①低溫超速離心機(jī)（EVOLUTION TMKC，美國(guó)制造）。②微波爐（型號(hào)：HWL09PA，杭州耀博生物科技有限公司）。③鼠抗人單核巨噬細(xì)胞 CD68 單克隆抗體（即用型）（型號(hào)：fs-Y1166，上海撫生實(shí)業(yè)有限公司）。④鼠抗人平滑肌細(xì)胞α-actin單克隆抗體（即用型）（型號(hào)：LOP1055上海酶聯(lián)生物研究所）。⑤兔抗人TNF-α多克隆抗體（濃縮型，工作濃度為 1：200）（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。⑥SP試劑盒（北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司）。⑦濃縮型DAB 試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 切片及染色通過手術(shù)獲取患者冠脈粥樣硬化斑塊標(biāo)本，使用10%濃度福爾馬林溶液對(duì)選定的冠脈標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)固定，對(duì)冠脈標(biāo)本的左主干、左前降支、左旋支以及右側(cè)做間隔為1 cm的連續(xù)取材，經(jīng)脫水、透明、浸蠟以及石蠟包埋等一系列處理后進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為4μm，最后將冠狀動(dòng)脈標(biāo)本切片放入二甲苯以及不同濃度酒精溶液中進(jìn)行常規(guī)脫蠟和水化處理。對(duì)處理后的冠脈標(biāo)本切片進(jìn)行HE和EVG染色，部分切片水化后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.3.2 分組使用顯微圖像分析系統(tǒng)（Imagepro-Plus 6.0），分別對(duì)標(biāo)本斑塊面積和脂質(zhì)壞死中心面積進(jìn)行測(cè)量。參照病史、顯微鏡觀察結(jié)果以及EVG 染色血管組織學(xué)形態(tài)特點(diǎn)，結(jié)合HE染色結(jié)果，病理特征，根據(jù)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的組織學(xué)病理學(xué)特征將標(biāo)本分為正常對(duì)照組（21例）、穩(wěn)定斑塊組（28例）和不穩(wěn)定板塊組（31例），其中斑塊評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行判定：穩(wěn)定斑塊組：主要病變?yōu)槔w維結(jié)締組織，纖維帽厚或斑塊內(nèi)膜增厚，不存在脂質(zhì)壞死中心或脂質(zhì)壞死中心占斑塊大小的40%以下。不穩(wěn)定斑塊組：纖維帽較薄，存在大的偏心性脂質(zhì)壞死中心占斑塊的40%以上。

1.3.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)①將冠狀動(dòng)脈石蠟切片放入60～65℃的烤箱中烘烤2～3 h。②使用不同濃度的酒精溶液對(duì)烤好的冠狀動(dòng)脈石蠟切片進(jìn)行水化處理，然后使用二甲苯進(jìn)行脫蠟，使用流水沖洗10 min，使用PBS沖洗3次，每次3 min，擦干。③為防止內(nèi)源性過氧化物酶發(fā)生作用，在室溫下，3%濃度的過氧化氫去離子水進(jìn)行孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min，擦干。④使用枸櫞酸微波熱修復(fù)對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)，時(shí)間為15 min，使抗原暴露。⑤完成抗原修復(fù)后，在自然環(huán)境下使冠狀動(dòng)脈切片降至室溫，重復(fù)PBS沖洗3次，每次3 min，擦干。⑥室溫狀態(tài)下加入5%小牛血清蛋白，作用是封閉非特異性抗體20 min。⑦傾去小牛血清，將標(biāo)本切片擦干，分別加入稀釋后的一抗，放入4℃冰箱中過夜（約18 h）。⑧將標(biāo)本切片預(yù)熱15 min，重復(fù)PBS沖洗3次，每次3 min。⑨在室溫條件下加入生物素化的二抗，孵育15 min，重復(fù)PBS沖洗3次，每次3 min。⑩室溫下進(jìn)行鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶濕盒孵育15 min，重復(fù)PBS沖洗3次，每次3 min。?使用DAB溶液進(jìn)行顯色處理，流水沖洗后使用蘇木素進(jìn)行染色，后逐級(jí)脫水，二甲苯進(jìn)行透明處理，使用中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判定巨噬細(xì)胞判定：CD-68染色結(jié)果呈陽性的細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞判定：α-actin染色結(jié)果呈陽性的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞。腫瘤壞死因子α（TNF-α）的判定方法參照許良忠等《免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)》[6]中對(duì)免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，綜合分析切片中陽性細(xì)胞占所觀察同類別細(xì)胞數(shù)的百分比以陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)度，根據(jù)切片中陽性細(xì)胞占觀察細(xì)胞總數(shù)的百分比分為4個(gè)等級(jí)：≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；≥51%為3分。根據(jù)細(xì)胞染色程度判定陽性程度：基本沒有著色為0分；呈淡黃色為1分；呈黃棕色為2分；呈棕褐色為3分.將每張切片著色細(xì)胞百分比得分與著色程度得分相乘得出最終得分。0～1分為陰性（－）；2～3分為弱陽性（+）；4～6分為中等陽性（++）；6分以上為強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析使用軟件SPSS 14.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理分析。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞表達(dá)情況正常對(duì)照組中CD68幾乎沒有表達(dá)，陽性率為0%；在穩(wěn)定斑塊組表達(dá)強(qiáng)度為（－ ～+++），陽性率為60.71%；不穩(wěn)定斑塊組表達(dá)強(qiáng)度為（－～+++），陽性率為96.77%；穩(wěn)定斑塊組與不穩(wěn)定斑塊組CD68陽性率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組陽性率分別與正常對(duì)照組相比差異均比較明顯（P＜0.05）（表1）。

2.2 平滑肌細(xì)胞表達(dá)情況正常對(duì)照組中平滑肌細(xì)胞表達(dá)均為強(qiáng)陽性（+++），陽性率100%；穩(wěn)定斑塊組中表達(dá)強(qiáng)度為（－～+++），陽性率為53.57%；不穩(wěn)定斑塊組表達(dá)強(qiáng)度為（－～+++），陽性率為9.68%；穩(wěn)定斑塊組與不穩(wěn)定斑塊組α-actin陽性率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組陽性率分別與正常對(duì)照組相比差異均比較明顯（P＜0.05）（表2）。

2.3 TNF-α在冠脈內(nèi)膜的表達(dá)情況TNF-α在正常對(duì)照組內(nèi)膜無表達(dá)，陽性率為0%；TNF-α在病變冠脈中表達(dá)增強(qiáng)，穩(wěn)定斑塊組中表達(dá)強(qiáng)度為（－～+++），陽性率為64.28%；不穩(wěn)定斑塊組表達(dá)強(qiáng)度為（－～+++），陽性率為93.54%；穩(wěn)定斑塊組與不穩(wěn)定斑塊組α-actin陽性率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組陽性率分別與正常對(duì)照組相比差異均比較明顯（P＜0.05，表3）。

2.4 TNF-α在冠脈中膜的表達(dá)情況正常對(duì)照組中膜無TNF-α的表達(dá)，陽性率為0%；穩(wěn)定斑塊組中表達(dá)強(qiáng)度為（－～+++），陽性率為28.57%；不穩(wěn)定斑塊組表達(dá)強(qiáng)度為（－～+++），陽性率為61.29%；穩(wěn)定斑塊組與不穩(wěn)定斑塊組α-actin陽性率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組陽性率分別與正常對(duì)照組相比差異均比較明顯（P＜0.05，表4）。

3 討論

有研究表明[7,8]，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂是引起一系列急性心腦血管疾病的主要因素，并且斑塊的破裂幾乎全部由不穩(wěn)定性斑塊引起，因此早期對(duì)不穩(wěn)定性斑塊的處理對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)性的診斷具有重要意義。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家逐漸從分子水平上對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行更加深入的研究，一項(xiàng)新的研究結(jié)果表明動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展，與人體的免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡都有密切聯(lián)系[9]。TNF-α是由被激活的巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生的一種多肽，具有二聚體、三聚體或多聚體形式[10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，TNF-α能與靶細(xì)胞上的上TNF-α受體相結(jié)合后發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)，在應(yīng)激狀態(tài)下，TNF-α可參與多種疾病的病理生理過程，可導(dǎo)致血栓形成，細(xì)胞凋亡，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中扮演著重要的角色。目前醫(yī)學(xué)上廣泛認(rèn)為TNF-α是導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能絮亂、內(nèi)膜增生的重要因素之一[12,13]。

表1 CD68在三組中的表達(dá)情況

表2 α-actin在三組中的表達(dá)情況

表3 TNF-α在冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜的表達(dá)情況

表4 TNF-α在冠狀動(dòng)脈中膜的表達(dá)情況

近年來的研究發(fā)現(xiàn)[14]，TNF-α與動(dòng)脈硬化有著密切聯(lián)系。TNF-α能夠誘導(dǎo)血小板黏附，增強(qiáng)白細(xì)胞的趨化作用，引起病灶住址周圍的細(xì)胞聚集，導(dǎo)致血管細(xì)胞異常增殖[15]；對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成直接損傷，誘導(dǎo)脂質(zhì)沉淀形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；導(dǎo)致血管炎癥的發(fā)生[16]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[17]，TNF-α介導(dǎo)了動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，參與了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，在對(duì)急性動(dòng)脈硬化綜合癥患者的抗炎治療中發(fā)現(xiàn)抗炎藥物均能降低TNF-α的水平，由此可以推斷TNF-α與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的炎癥有關(guān)。本次研究表明，正常人的動(dòng)脈組織中沒有TNF-α的表達(dá)，而病變動(dòng)脈組織斑塊中TNF-α的表達(dá)增強(qiáng)，主要表達(dá)于CD68、α-actin細(xì)胞中，不穩(wěn)定斑塊的內(nèi)膜與中膜TNF-α的表達(dá)相對(duì)較高，且內(nèi)膜表達(dá)強(qiáng)于中膜。

綜上所述，在正常動(dòng)脈組織中沒有TNF-α的表達(dá)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在TNF-α的表達(dá)，可推測(cè)TNF-α的表達(dá)能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性，是動(dòng)脈粥樣硬化病變形成和發(fā)展的重要因素之一。