冠心病患者血清miR-335、LTBP-2水平變化及臨床意義

楚艷貞，張彥昂，于林君

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。儆谂R床上最為常見的心血管疾病之一，已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類生命健康安全的重大疾病。如不予以及時有效的治療，隨著病情的不斷進展會導(dǎo)致不穩(wěn)定型心絞痛以及急性心肌梗死的發(fā)生，進一步增加了臨床治療難度，增加了患者的死亡風(fēng)險[1,2]。因此，尋找一種早期有效的診斷和監(jiān)測冠心病患者病情進展情況的手段顯得尤為重要，對臨床針對性干預(yù)措施的制定、延緩疾病進展以及降低臨床病死率均有極其重要的意義。目前，臨床上診斷冠心病的金標(biāo)準(zhǔn)為冠狀動脈（冠脈）造影，而該診斷方式會對患者造成一定的創(chuàng)傷，且無法用于冠心病的早期診斷及病情嚴(yán)重程度判斷，存在一定的局限性[3]。而隨著相關(guān)研究的深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸（micro RNA，miR）與多種心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展存在密切相關(guān)，且在血清等體液中穩(wěn)定存在[4]，miR-335屬于miRNAs亞型之一，可能成為冠心病的早期診斷生物標(biāo)記物之一。而潛在轉(zhuǎn)化生長因子結(jié)合蛋白2（LTBP-2）屬于細胞外基質(zhì)糖蛋白之一，在機體動脈損傷、細胞黏附以及彈性纖維凝聚等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5]。鑒于此，本文通過研究冠心病患者血清miR-335、LTBP-2水平變化及臨床意義，旨在為臨床冠心病的診斷、治療以及預(yù)后評估提供新的靶點和思路，現(xiàn)作以下報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年3月至2018年3月于解放軍第153醫(yī)院收治的冠心病患者120例為研究對象，記為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)[6]：①所有患者均與國際心臟病學(xué)會和協(xié)會/世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)相符；②均經(jīng)冠脈造影確診存在1支或1支以上的冠脈血管狹窄≥50%；③臨床病歷資料完整；④入院前未接受任何相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病者；②伴有肝、腎、肺等臟器功能嚴(yán)重障礙或惡性腫瘤者；③存在精神疾病或交流溝通障礙者；④妊娠期或哺乳期婦女；⑤既往接受過血管重建術(shù)或冠狀動脈旁路移植術(shù)治療者；⑥正參與其他研究者。其中男性患者72例，女性患者48例，年齡42～74（58.38±5.19）歲；疾病類型：穩(wěn)定型心絞痛40例，不穩(wěn)定型心絞痛43例，急性心肌梗死37例；血管病變支數(shù)：單支血管病變31例，2支血管病變49例，多支血管病變40例。另取同期于我院接受體檢的健康人員50例為對照組。其中男性29例，女性21例，年齡41～72（58.20±5.23）歲。兩組性別、年齡比較無明顯差異（P＞0.05）。兩組人員均簽署了知情同意書，我院倫理委員會已批準(zhǔn)。

1.2 研究方法①根據(jù)Gensini積分的不同將研究組患者分為輕度病變組36例、中度病變組43例、重度病變組41例。其中Gensini積分評估標(biāo)準(zhǔn)如下[7]：冠脈無狹窄即為0分，冠脈狹窄在0～25%之間即為1分，冠脈狹窄在26%～50%之間即為2分，冠脈狹窄在51%～75%之間即為4分，冠脈狹窄在76%～90%之間即為8分，冠脈狹窄在91%～99%間即為16分，冠脈狹窄100%即為32分。每例患者的各個分支積分相加結(jié)果即為最終Gensini積分，其中Gensini積分在0～25分間即為輕度病變，Gensini積分在26～49分間即為中度病變，Gensini積分≥50分即為重度病變。②標(biāo)本采集：兩組人員入院后均采集清晨空腹靜脈血5 ml，以3000 r/min離心10 min，取上層血清保存于-80℃冰箱中待檢。③采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測兩組人員血清miR-335表達情況：嚴(yán)格根據(jù)血清/血漿miRNA提取分離試劑盒說明書進行RNA提取相關(guān)操作，采用OneDrop核酸蛋白質(zhì)測定儀檢測濃度，并吸取光度，以1.8～2.1的RNA樣本用于后續(xù)實驗。嚴(yán)格根據(jù)miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將樣本保存于-20℃冰箱中，使用前將其已無菌ddH2O稀釋100倍。其中PCR反應(yīng)體系包括2×miRcuet Plus miRNA Premix 10 μl，10 μmol/L的上游引物與下游引物各0.4 μl，已被稀釋完成的cDNA 1 μl，50×ROX Reference Dye 2 μl，ddH2O 6.2 μl。PCR反應(yīng)參數(shù)如下：95℃預(yù)變性15 min，94℃ 20 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。于60℃時采集熒光信號，以U6為內(nèi)參基因。采用2-△△Ct法計算miR-335相對表達量，每份樣本均連續(xù)測定3次，取平均值。④采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清LTBP-2表達情況：具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行，試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技。

1.3 觀察指標(biāo)分別比較研究組與對照組血清miR-335、LTBP-2水平，比較不同Gensini積分患者的miR-335、LTBP-2水平，分析冠心病患者血清miR-335、LTBP-2水平與Gensini積分的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗。各項指標(biāo)的關(guān)系予以Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組與對照組血清miR-335、LTBP-2水平對比研究組血清miR-335水平低于對照組，而LTBP-2水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05，表1）。

2.2 不同Gensini積分患者的血清miR-335、LTBP-2水平對比輕度病變組、中度病變組、重度病變組患者的血清miR-335水平呈逐漸降低趨勢，而LTBP-2水平呈逐漸升高趨勢，且經(jīng)單因素方差分析，各組間對比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05，表2）。

2.3 冠心病患者血清miR-335、LTBP-2水平與Gensini積分的相關(guān)性分析經(jīng)Pearson相關(guān)性分析可得：冠心病患者血清miR-335與Gensini積分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.683，P＜0.05），而LTBP-2呈與Gensini積分正相關(guān)關(guān)系（r=0.626，P＜0.05），且血清miR-335與LTBP-2水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.711，P＜0.05）。

表1 研究組與對照組血清miR-335、LTBP-2水平對比

表2 不同Gensini積分患者的血清miR-335、LTBP-2水平對比

3 討論

冠心病的具體發(fā)病機制尚未完全闡明，雖然目前臨床上針對冠心病的介入治療以及藥物治療均取得明顯的進步，但由于該病病情復(fù)雜，有較高的發(fā)病率及病死率[8]。因此，如何早期有效對冠心病患者進行診斷，并對其病情進展進行有效監(jiān)測顯得尤為重要，是降低患者潛在血管事件發(fā)生及改善預(yù)后的重要途徑[9,10]。目前，尋找一種新型的冠心病臨床診斷、病情判斷生物標(biāo)記物已成為國內(nèi)外研究學(xué)者共同關(guān)注的熱點。其中miRNAs作為一種可特異性結(jié)合靶向mRNA的短序列非編碼RNA，其參與了細胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤形成等生物學(xué)過程[11,12]。miR-335主要定位在人類染色體7q32.2上，已被證實參與了人類胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。與此同時，LTBP-2廣泛存在于人體心臟、肝臟以及肺臟中，參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。然而，關(guān)于miR-335與LTBP-2在心血管疾病中的研究報道并不多見。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，研究組血清miR-335水平，低于對照組，而LTBP-2水平高于對照組，這與林能波等研究報道結(jié)論基本一致[13]，提示了冠心病患者血清miR-335存在明顯低表達，而LTBP-2水平存在明顯高表達，也說明了上述兩項指標(biāo)可能成為評估冠心病患者病情嚴(yán)重程度的有效指標(biāo)，可能與miR-335及LTBP-2在機體中的作用機制有關(guān)。miR-335在冠心病患者機體中的低表達主要是通過促使鈣調(diào)蛋白的表達而損害其心肌組織。而LTBP-2則可通過影響心肌重構(gòu)等因素而導(dǎo)致患者病情的產(chǎn)生及進展。然而，國內(nèi)外有不少研究報道證實[14]，miR-335在多種腫瘤疾病中均存在表達異常，這說明了其應(yīng)用于冠心病診斷中的特異性較低。因此，在實際臨床工作中可通過聯(lián)合檢測miR-335與LTBP-2水平，達到提高冠心病早期診斷的敏感性與特異性。此外，輕度病變組、中度病變組、中度病變組患者的血清miR-335水平呈逐漸降低趨勢，而LTBP-2水平呈逐漸升高趨勢，且經(jīng)單因素方差分析，各組間對比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這提示了隨著冠心病患者病情逐漸惡化，miR-335表達越低，而LTBP-2越高，臨床工作中可能通過對上述兩項指標(biāo)水平進行檢測，從而有助于判斷冠心病患者的病情嚴(yán)重程度。有研究學(xué)者通過探討miR-335對大鼠模型微血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，miR-335可能在缺氧復(fù)氧過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性調(diào)控作用，推測其可能成為缺血再灌注損傷的治療新靶點[15]。而Zhang等[16]通過對292例急性呼吸困難患者進行研究發(fā)現(xiàn)：LTBP-2有望成為臨床心血管疾病早期以及預(yù)后的生物標(biāo)志物。上述研究結(jié)果均為miR-335與LTBP-2成為冠心病的診斷指標(biāo)提供了可能性。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析可得冠心病患者血清miR-335與Gensini積分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而LTBP-2呈與Gensini積分正相關(guān)關(guān)系，且血清miR-335與LTBP-2水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這充分證明了上述結(jié)果，提示了血清miR-335與LTBP-2水平與冠心病患者病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可隨著病情的變化而變化。臨床工作中可通過聯(lián)合檢查miR-335與LTBP-2水平，從而有效反映冠心病患者的病情變化情況，進一步為臨床治療方案的制定提供參考依據(jù)，達到改善患者預(yù)后的目的。

綜上所述，冠心病患者血清miR-335存在明顯低表達，而LTBP-2存在明顯高表達，臨床工作中可通過聯(lián)合檢測上述兩項指標(biāo)水平，從而對冠心病患者進行早期有效診斷，同時對其病情嚴(yán)重程度予以準(zhǔn)確評估。然而，本研究尚且存在樣本量較少的缺陷，從而可能導(dǎo)致研究結(jié)果發(fā)生一定程度的偏倚。因此，在今后的研究中我們應(yīng)增大樣本量，以獲取更為準(zhǔn)確、可靠的數(shù)據(jù)。