甘膽酸試劑盒的性能評(píng)價(jià)

李忠信，謝茜，周方方，付光宇(通信作者)

鄭州安圖生物股份有限公司 (河南鄭州 450016)

近年來(lái)，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)和磁微粒載體技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，使得免疫檢測(cè)靈敏、快速、準(zhǔn)確及特異度強(qiáng)，因此得到了快速發(fā)展。本公司應(yīng)用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在血清甘膽酸的免疫檢測(cè)上，評(píng)價(jià)肝細(xì)胞功能及其肝膽系物質(zhì)循環(huán)功能。甘膽酸是肝膽疾病的主要診斷指標(biāo)，近年來(lái)文獻(xiàn)[1-2]報(bào)道該項(xiàng)目與肝纖維化血清標(biāo)志物聯(lián)合檢查在肝損傷、肝癌、肝硬化等疾病方面具有較高的診斷價(jià)值，例如妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)患者甘膽酸、血脂水平變化顯著，可以作為ICP診斷敏感可靠的指標(biāo)，對(duì)ICP的早期診斷及檢測(cè)具有重要的臨床意義[3]；劉茵等[4]認(rèn)為血清甘膽酸是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞功能及肝膽系物質(zhì)循環(huán)功能的敏感指標(biāo)之一，肝炎后肝硬化患者甘膽酸水平明顯升高。王昉等[5]認(rèn)為血清甘膽酸可較為靈敏地反映新生兒肝功能病變，對(duì)新生兒高膽紅素血癥的診斷具有重要價(jià)值。張有濤等[6]認(rèn)為甘膽酸可反映肝細(xì)胞的受損程度及肝損害的動(dòng)態(tài)過(guò)程，對(duì)肝臟疾病的判斷和治療具有重要的診斷價(jià)值。

甘膽酸是膽酸與甘氨酸結(jié)合而成的結(jié)合型膽酸之一，相對(duì)分子質(zhì)量為465.6。肝細(xì)胞受損時(shí)，攝取甘膽酸能力下降，致使血液中甘膽酸含量增高；膽汁郁滯時(shí)，肝臟排泄膽酸發(fā)生障礙，返流血液循環(huán)的甘膽酸增高，使得血清甘膽酸含量增高[7]。因此，測(cè)定血清甘膽酸是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞功能及其肝膽系物質(zhì)循環(huán)功能的敏感指標(biāo)之一，且在甘膽酸與血清Ⅳ型膠原、透明質(zhì)酸、前白蛋白(PA)進(jìn)行動(dòng)態(tài)聯(lián)合檢查對(duì)肝損傷、肝癌、肝硬化、肝膽胃腸消化系統(tǒng)及預(yù)后判斷等方面具有極其重要的診斷價(jià)值[8]。

本公司旨在為臨床慢性肝炎、輕度肝硬化、肝癌等疾病的診斷提供可靠的分析指標(biāo)，建立一種靈敏度高、速度快、準(zhǔn)確度高及特異度強(qiáng)的甘膽酸磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑盒為鄭州安圖生物工程股份有限公司自制；參比試劑盒為蘇州博源醫(yī)療科技有限公司試劑盒；儀器為安圖生物Autolumo A2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀。

1.2 方法

1.2.1靈敏度建立方法

根據(jù)EP17-A2[9]選擇5份接近0值的臨床樣本，每個(gè)樣本測(cè)定3次，測(cè)定4 d，進(jìn)行空白限(LOB)的建立。選擇1～4倍LOB的5份臨床樣本，每個(gè)樣本測(cè)定3次，測(cè)定4 d，進(jìn)行檢出限(LOD)的建立。

1.2.2準(zhǔn)確度評(píng)估方法

1.2.3試劑盒精密度評(píng)估

根據(jù)EP05-A3[11]，評(píng)估試劑盒的批內(nèi)、批間及總不精密度。

1.2.4試劑盒線性范圍評(píng)估方法

根據(jù)CLSI EP06-A[12]文件，建立本試劑盒的線性范圍。選擇線性范圍上限100%～130%的臨床樣本10份，用低值樣本依次稀釋制備10個(gè)系列的評(píng)價(jià)樣本(每個(gè)樣本測(cè)定4次)。

采用平均斜率法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以X表示各樣本的預(yù)期值，以Y表示各樣本的實(shí)測(cè)均值，形成10對(duì)預(yù)期值、實(shí)測(cè)值，用直線回歸對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到10組線性回歸方程(表1)。

1.2.5藥物干擾

于臨床樣本中添加25種臨床常見治療藥物，檢測(cè)25種臨床常見治療藥物對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。

1.2.6參考值范圍的確定

根據(jù)EP28-A3C[13]，采用本試劑盒建立一個(gè)足夠可靠和實(shí)用的參考區(qū)間。利用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0，采用K-S檢驗(yàn)，樣本檢測(cè)值呈正態(tài)分布。故采用95%百分?jǐn)?shù)范圍的正態(tài)分布法，建立參考值范圍。

2 結(jié)果

2.1 試劑盒的靈敏度

選用“1.2.1”的實(shí)驗(yàn)方法，本試劑盒的LOB為0.05 μg/ml，LOD為0.30 μg/ml，功能靈敏度(FS)為0.40 μg/ml。

2.2 試劑盒的準(zhǔn)確度

選用“1.2.2”的實(shí)驗(yàn)方法，本試劑盒的回收率為85.20%～113.40%。

2.3 試劑盒的精密度

選用“1.2.3”的實(shí)驗(yàn)方法，3批試劑盒的批內(nèi)精密度<8% ，批間精密度<10%，總不精密度<15%。

2.4 線性范圍的建立

選用“1.2.4”的實(shí)驗(yàn)方法，建立本試劑盒的線性范圍。表1為10份樣本的線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)R2。

表1 10份樣本的線性回歸方程

在完全理想狀態(tài)下，實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值間的回歸線為通過(guò)原點(diǎn)、斜率為1的直線，即斜率b1為1，截距b0為0。由表1可知，10份樣本回歸方程b1在1.00±0.03范圍內(nèi)，b0近于0。通過(guò)表1進(jìn)行分析，確定線性范圍1～50 μg/ml。

2.5 臨床治療藥物影響評(píng)估

于臨床樣本中添加25種常見治療藥物，25種藥物對(duì)本試劑盒檢測(cè)結(jié)果無(wú)干擾，臨床偏差在8%以內(nèi)。

2.6 試劑盒的參考值范圍

由于個(gè)體差異及地域、年齡和性別的不同，不同人血清中的甘膽酸含量會(huì)有一定的差異。選用“1.2.6”的實(shí)驗(yàn)方法，本試劑盒建立的參考值范圍為0～2.7 μg/ml。該參考值范圍與蘇州博源醫(yī)療科技有限公司一致。

2.7 臨床研究

使用本試劑盒與蘇州博源醫(yī)療科技有限公司試劑盒同時(shí)測(cè)定604份臨床樣本，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行泊松相關(guān)系數(shù)分析，回歸方程Y=0.9515X-0.3613，相關(guān)系數(shù)R2=0.9018。

3 討論

在本試劑盒性能指標(biāo)的建立過(guò)程中，建立了靈敏度、線性范圍、回收率、精密性、參考值范圍等性能指標(biāo)。肝纖維化四項(xiàng)1 000 ng/ml透明質(zhì)酸、100 ng/ml Ⅲ型前膠原氨端肽、1 000 ng/ml Ⅳ型膠原和800 ng/ml層粘連蛋白，以及400 μg/ml孕酮、170 μg/ml睪酮對(duì)本試劑盒檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，另外25種臨床診斷藥物對(duì)本試劑盒的檢測(cè)也無(wú)影響，這些性能指標(biāo)保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可信。

蘇州博源采用均相酶免疫法進(jìn)行測(cè)定，存在一定的方法學(xué)限制，靈敏度、精密性較低。本研究采用磁微粒全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，靈敏度和精密性得到顯著提升。

在臨床研究過(guò)程中，本試劑盒與參比試劑盒測(cè)定值高度相關(guān)，即該試劑盒與參比試劑盒的測(cè)定結(jié)果具有較高的符合度，具有同等的臨床診斷價(jià)值。甘膽酸對(duì)于肝病樣本的檢出率為60%左右，肝病和肝硬化樣本的陽(yáng)性率大致相同，聯(lián)合肝纖維化四項(xiàng)檢測(cè)意義重大，有助于臨床醫(yī)師對(duì)結(jié)果進(jìn)行解讀。在人體內(nèi)甘膽酸正常代謝途徑為腸-肝循環(huán)，甘膽酸由肝細(xì)胞合成，經(jīng)毛細(xì)膽管、膽管排入膽囊，隨同膽汁進(jìn)入十二指腸[8]，因此甘膽酸與肝臟關(guān)系極為密切。肝臟的代謝與攝取能力將直接影響體內(nèi)甘膽酸的水平，肝病患者的肝臟代謝與攝取能力降低，因此體內(nèi)甘膽酸含量顯著升高，試劑盒檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷結(jié)果一致。

綜上所述，本研究建立的甘膽酸磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量免疫分析方法靈敏度高、測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高及特異度強(qiáng)，利于臨床研究的開展，可為多種疾病的臨床治療提供可靠的性能指標(biāo)。