不同濃度多西環(huán)素對(duì)堿燒傷大鼠角膜中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)的影響△

易瓊 鄒文進(jìn)

眼睛的化學(xué)損傷占眼外傷的11.5%～22.1%，最常見(jiàn)的原因是從職業(yè)中接觸堿[1]。堿能夠迅速穿透眼前部，造成廣泛的組織損傷，引起角膜感染、潰瘍、穿孔、新生血管形成和混濁[2]。近年來(lái)研究認(rèn)為，在影響角膜堿燒傷愈合反應(yīng)的眾多細(xì)胞因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在受損組織的再生中起關(guān)鍵作用，特別是TGF-β1[3]，它能誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)膠原纖維的降解[4]。因此，降低TGF-β1和MMP-9的表達(dá)可能有利于堿燒傷后角膜的恢復(fù)。本課題組前期已經(jīng)證明，多西環(huán)素對(duì)堿燒傷大鼠角膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及新生血管形成均有抑制作用[5-6]，但是尚未清楚多西環(huán)素對(duì)TGF-β1和MMP-9的作用。因此，本研究以大鼠角膜堿燒傷為模型，觀察不同濃度多西環(huán)素對(duì)堿燒傷后大鼠角膜中TGF-β1及MMP-9表達(dá)的影響及相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康雄性SPF級(jí)SD大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前通過(guò)裂隙燈檢查排除眼前節(jié)疾病。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、0.5 g·L-1多西環(huán)素組、1.0 g·L-1多西環(huán)素組，均以右眼為實(shí)驗(yàn)眼，剔除造模后角膜穿孔、前房積血等的5只(5眼)大鼠。每組15只15眼。實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理保護(hù)條例。

1.1.2 主要試劑及儀器顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械)；眼科顯微鏡(日本Olympus公司)。多西環(huán)素粉劑 (Doxycycline，美國(guó) Sigma 公司)；Trizol核酸蛋白提取試劑、cDNA合成試劑盒、2×Taq PCR MasterMix以及引物(日本TaKaRa公司)；TGF-β1蛋白ELISA試劑盒及MMP-9蛋白ELISA試劑盒(武漢華美生物)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠角膜堿燒傷模型的制備各組大鼠均右眼造模。堿燒傷模型建立前1 d用5.0 g·L-1妥布霉素眼液滴眼預(yù)防感染，每天4次。腹腔內(nèi)注射100 g·L-1水合氯醛(4 mL·kg-1體質(zhì)量)麻醉大鼠，丁卡因滴眼行表面麻醉，棉簽擦干結(jié)膜囊內(nèi)液體。自制堿燒傷模具：200 μL容積的槍頭距尾部15 mm處水平切去槍頭前端，用刀片小心將切口端外部削薄，在槍頭內(nèi)填塞適量棉花，使槍頭切口端外露的棉花形成一個(gè)平整微凸面，松緊度適中，槍頭尾部用紙膠布封貼，高壓高溫滅菌備用。于模具內(nèi)滴入200 μL 1 mol·L-1NaOH，將模具垂直放置于大鼠右側(cè)角膜中央25 s，迅速用 20 mL生理鹽水沖洗燒傷區(qū)及結(jié)膜囊1 min，沖洗完畢后可見(jiàn)角膜中央有一圓形灰白色燒灼斑，直徑約4 mm。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：角膜基質(zhì)層水腫、混濁明顯，虹膜隱約可見(jiàn)。堿燒傷后立即給予眼液滴眼，三組分別用眼液溶媒、0.5 g·L-1多西環(huán)素、1.0 g·L-1多西環(huán)素滴右眼，溶媒除不含多西環(huán)素外，其余成分均與多西環(huán)素眼液相同，每天4次，每次20 μL，至臨床觀察期結(jié)束。

1.2.2 活體觀察造模成功后，每天滴藥前用顯微鏡觀察眼前段大體情況，并于角膜堿燒傷后第3天、第7天、第14天對(duì)各組大鼠右眼進(jìn)行角膜混濁程度評(píng)分。角膜混濁程度的評(píng)分參照Holland等[7]的標(biāo)準(zhǔn)：0分：角膜透明無(wú)混濁；1分：角膜輕度混濁，虹膜紋理可見(jiàn)；2分：角膜混濁較重，虹膜紋理不清；3分：角膜混濁進(jìn)一步加重，但可見(jiàn)瞳孔；4分：角膜完全混濁，看不清瞳孔。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)角膜中TGF-β1和MMP-9 mRNA的表達(dá)分別于堿燒傷后第3天、第7天、第14天每組隨機(jī)選取5只大鼠處死，無(wú)菌條件下沿角鞏膜緣剪下右眼角膜組織，將角膜組織分成兩等份，一份迅速存貯于-80 ℃冰箱備用，一份放于裝有裂解Buffer Rl的1.5 mL離心管內(nèi)進(jìn)行勻漿，采用Trizol法測(cè)定各角膜組織中提取的RNA濃度及純度，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)而利用cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；TGF-β1、MMP-9和GAPDH均為40個(gè)循環(huán)。各指標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)量使用2-△△Ct計(jì)算。

1.2.4 ELISA檢測(cè)角膜中TGF-β1和MMP-9蛋白含量從-80 ℃冰箱取出各組堿燒傷后第3天、第7天、第14天的另一份角膜進(jìn)行組織勻漿，-20 ℃過(guò)夜，反復(fù)凍融2次后于低溫離心機(jī)5000 r·min-14 ℃ 離心5 min，取上清備用。按照試劑盒說(shuō)明操作行ELISA檢測(cè)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光度(A)值。

2 結(jié)果

2.1 活體觀察角膜混濁度堿燒傷后第3天：3組角膜基質(zhì)均明顯水腫、混濁，角膜上皮缺損，虹膜紋理不清，3組間角膜混濁程度評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.40，P=0.28)。堿燒傷后第7天：對(duì)照組角膜混濁，隱約可見(jiàn)瞳孔，3組間角膜混濁程度評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.80，P=0.00)，且1.0 g·L-1多西環(huán)素組角膜混濁程度輕于0.5 g·L-1多西環(huán)素組，2組又均輕于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。堿燒傷后第14天：對(duì)照組可見(jiàn)新生血管長(zhǎng)入混濁區(qū)，看不見(jiàn)瞳孔，3組間角膜混濁程度評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.00，P=0.00)，且1.0 g·L-1多西環(huán)素組角膜混濁程度輕于0.5 g·L-1多西環(huán)素組，2組又均輕于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。1.0 g·L-1多西環(huán)素較0.5 g·L-1多西環(huán)素更能減輕角膜混濁程度，為最佳濃度。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 大鼠角膜堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)3組角膜混濁情況

表1 大鼠角膜堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)3組角膜混濁程度評(píng)分比較

組別角膜混濁程度評(píng)分/分堿燒傷后第3天堿燒傷后第7天堿燒傷后第14天對(duì)照組2.00±0.71 3.40±0.55 3.20±0.45 0.5 g·L-1多西環(huán)素組1.80±0.45 2.80±0.45? 2.20±0.45?1.0 g·L-1多西環(huán)素組1.60±0.55 2.00±0.00?△ 0.60±0.55?△

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與0.5 g·L-1多西環(huán)素組相比，△P<0.05

2.2 各組TGF-β1、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)情況堿燒傷后第3天、第7天，0.5 g·L-1多西環(huán)素組、1.0 g·L-1多西環(huán)素組TGF-β1、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，且1.0 g·L-1多西環(huán)素組低于0.5 g·L-1多西環(huán)素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。堿燒傷后第14天，TGF-β1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且1.0 g·L-1多西環(huán)素組低于0.5 g·L-1多西環(huán)素組，2組又均低于對(duì)照組(均為P<0.05)；MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2和表3。

2.3 各組TGF-β1、MMP-9蛋白表達(dá)情況堿燒傷后第3天、第7天，0.5 g·L-1多西環(huán)素組、1.0 g·L-1多西環(huán)素組TGF-β1、MMP-9 蛋白表達(dá)量均低于對(duì)照組，且1.0 g·L-1多西環(huán)素組低于0.5 g·L-1多西環(huán)素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。堿燒傷后第14 天，TGF-β1蛋白的表達(dá)量在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且1.0 g·L-1多西環(huán)素組低于0.5 g·L-1多西環(huán)素組，2組又均低于對(duì)照組(均為P<0.05)；MMP-9蛋白的表達(dá)量3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2和表3。

表2 大鼠堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)3組角膜組織中TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)情況

組別TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量堿燒傷后第3天堿燒傷后第7天堿燒傷后第14天TGF-β1 蛋白表達(dá)水平/ng·L-1堿燒傷后第3天堿燒傷后第7天堿燒傷后第14天對(duì)照組1.01±0.201.03±0.261.01±0.14115.27±3.82120.27±7.37104.44±2.980.5 g·L-1多西環(huán)素組0.56±0.09?0.66±0.03?0.58±0.07?86.93±3.48?88.93±3.35?85.36±3.09?1.0 g·L-1多西環(huán)素組0.36±0.06?△0.44±0.04?△0.31±0.08?△71.76±2.10?△77.05±4.46?△70.95±4.68?△

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，與0.5 g·L-1多西環(huán)素組相比，△P<0.05

表3 大鼠堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)3組角膜組織中MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)情況

組別MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量堿燒傷后第3天堿燒傷后第7天堿燒傷后第14天MMP-9蛋白表達(dá)水平/ng·L-1堿燒傷后第3天堿燒傷后第7天堿燒傷后第14天對(duì)照組1.00±0.111.01±0.181.00±0.111005.15±17.231210.76±29.67772.82±24.210.5 g·L-1多西環(huán)素組0.40±0.03?0.60±0.04?0.88±0.10588.79±54.49?974.41±97.60?795.90±27.141.0 g·L-1多西環(huán)素組0.30±0.03?△0.43±0.03?△0.88±0.11427.35±57.46?△765.06±36.31?△802.16±23.83

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，與0.5 g·L-1多西環(huán)素組相比，△P<0.05

3 討論

角膜堿燒傷后，TGF-β1分泌增加，其與細(xì)胞表面受體結(jié)合，啟動(dòng)多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8]，還可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為α平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞，從而導(dǎo)致視力損傷[9]。此外，TGF-β1還可以誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的表達(dá)，如MMP-9、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和單核/巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1，它們分別參與基質(zhì)溶解、局部新生血管形成和炎癥的形成，TGF-β1的過(guò)度表達(dá)會(huì)加劇受損角膜的損傷[3，8]。Tovey等[10]研究表明，角膜堿燒傷后TGF-β1在角膜組織中表達(dá)上調(diào)，阻斷TGF-β1分泌可以預(yù)防角膜損傷后的纖維化，保護(hù)患者的視力。

MMPs是鋅和鈣依賴性內(nèi)肽酶家族，其分為四大類(lèi)：(1)膠原酶：可識(shí)別Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型天然原纖維；(2)明膠酶：可降解變性膠原(明膠)和基底膜成分；(3)間質(zhì)溶解素：可識(shí)別各種膠原蛋白和蛋白多糖，并激活其他MMPs；(4)膜型：可與細(xì)胞表面受體結(jié)合，并參與各種細(xì)胞周?chē)顒?dòng)[11-12]。角膜中MMPs的研究幾乎可以追溯到1962年Gross和Lapiere對(duì)膠原酶活性的首次表述。在這一發(fā)現(xiàn)后的幾年內(nèi)，報(bào)道出現(xiàn)了堿燒傷后兔和牛角膜中的膠原水解活性，這種類(lèi)型的傷害導(dǎo)致慢性角膜潰瘍，其特征在于角膜膠原基質(zhì)組織的破壞[13-14]。MMP-9是由基底角膜上皮細(xì)胞合成和分泌的主要MMP，其表達(dá)在角膜損傷數(shù)天內(nèi)迅速上升，2～4周后消失，主要參與基底膜的降解，其對(duì)基底膜的降解可導(dǎo)致角膜上皮再生的失敗和促進(jìn)基質(zhì)的致病性潰瘍和穿孔[15]。

本研究結(jié)果表明，堿燒傷后第3天，角膜上皮缺損，角膜水腫，虹膜紋理不清，3組之間角膜混濁程度評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；堿燒傷后第7天、第14天多西環(huán)素產(chǎn)生作用，0.5 g·L-1多西環(huán)素組、1.0 g·L-1多西環(huán)素組均較對(duì)照組角膜混濁程度明顯減輕，且1.0 g·L-1多西環(huán)素組角膜混濁程度輕于0.5 g·L-1多西環(huán)素組，3組間角膜混濁程度評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。0.5 g·L-1多西環(huán)素組角膜混濁程度雖然較對(duì)照組有所好轉(zhuǎn)，但還是影響視力，僅1.0 g·L-1多西環(huán)素組角膜幾乎恢復(fù)透明，治療效果理想。

多西環(huán)素對(duì)TGF-β1和MMP-9的調(diào)節(jié)作用已有研究，Yang等[16]發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素可抑制TGF-β和MMP-9在動(dòng)脈瘤中的表達(dá)，從而改善內(nèi)皮依賴性舒張，改善彈性纖維組織。Pflugfelder等[17]研究表明，多西環(huán)素通過(guò)與MMP-9結(jié)構(gòu)中心內(nèi)的鋅或鈣原子相互作用而起到MMP的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的作用，從而降低MMP-9的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，0.5 g·L-1多西環(huán)素組、1.0 g·L-1多西環(huán)素組在角膜堿燒傷后第3天、第7天與對(duì)照組相比均能降低角膜中TGF-β1、MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，且1.0 g·L-1多西環(huán)素組較0.5 g·L-1多西環(huán)素組更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，提示其效應(yīng)呈一定程度的劑量依賴關(guān)系。這與Kim等[18]提出的維生素A可以抑制大鼠角膜堿燒傷中TGF-β1和MMP-9的表達(dá)從而促進(jìn)傷口的愈合，抑制大鼠角膜堿燒傷后角膜降解和角膜混濁的形成結(jié)果一致。Corrales等[19]發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素可以降低MMP-9 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平并阻止炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子-α的增加。此外，本研究結(jié)果表明，堿燒傷后第3天、第7天，MMP-9與TGF-β1的表達(dá)趨勢(shì)相似，提示二者在角膜堿燒傷病理發(fā)展中存在依賴性或相關(guān)性。Kim等[20]實(shí)驗(yàn)表明，TGF-β1可濃度依賴性地通過(guò)激活人角膜上皮細(xì)胞中的信號(hào)通路來(lái)增加MMP-9的表達(dá)，而多西環(huán)素可以抑制這種TGF-β1刺激的MMP-9的表達(dá)。因此說(shuō)明，在堿燒傷病理發(fā)展過(guò)程中，很可能是多西環(huán)素首先抑制了TGF-β1的活性再進(jìn)一步使MMP-9的表達(dá)降低，進(jìn)而抑制角膜基底膜的降解，促進(jìn)角膜的愈合。堿燒傷后第14天，多西環(huán)素組角膜的混濁程度和TGF-β1的表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，但MMP-9的表達(dá)3組間無(wú)明顯差異，這可能是因?yàn)榻悄さ膿p傷愈合反應(yīng)接近完成，而多西環(huán)素可能直接通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)減少角膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而減輕角膜的混濁程度。

總之，本研究初步顯示，多西環(huán)素對(duì)堿燒傷大鼠角膜中TGF-β1及MMP-9的表達(dá)有抑制作用，并呈一定程度的劑量依賴性；多西環(huán)素很有可能通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞、抑制基質(zhì)的降解從而促進(jìn)堿燒傷角膜的修復(fù)。本研究結(jié)果為多西環(huán)素在大鼠堿燒傷中的應(yīng)用研究提供了一定的依據(jù)和基礎(chǔ)。