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    黑果枸杞原花青素對小鼠皮膚衰老模型的保護作用研究

    2019-05-20 11:41:44馬嘉藝郭硯冶娟馬文宇
    中國全科醫(yī)學 2019年15期
    關(guān)鍵詞:真皮層黑果彈力

    馬嘉藝,郭硯,冶娟,馬文宇

    隨著醫(yī)學的發(fā)展,人類的平均壽命不斷增長,皮膚衰老問題得到人們越來越多的關(guān)注。皮膚衰老是一種不可避免的生理變化過程,隨著年齡增長,皮膚角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞數(shù)量減少及功能下降,彈性蛋白和膠原蛋白合成減少及萎縮,皮膚變得缺乏彈性、松弛、粗糙,并伴有不規(guī)則色素沉著、皺紋等[1]。與此同時,人們對自然來源的抗氧化劑的需求也越來越多。黑果枸杞為茄科枸杞屬多年生灌木,是一種獨特的藥食兩用植物,在藏藥中稱為“旁瑪”[2]。研究證實,黑果枸杞果實中含有大量花色苷、原花青素、多糖、黃酮等生理活性成分,具有抗氧化、抗疲勞、延緩衰老、降血糖、降血脂、預防動脈粥樣硬化、增強免疫功能等作用[3]。分光光度法測得黑果枸杞的原花青素含量為16 μg/g,是藍莓的18倍[4]。目前國內(nèi)外對黑果枸杞的研究多集中于其常見生理活性成分的提取、純化、結(jié)構(gòu)分析及含量測定,尚未見對青海黑果枸杞原花青素抗衰老作用的研究。本文旨在從小鼠背部皮膚模型真皮層厚度、膠原纖維、彈力纖維及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9方面研究黑果枸杞原花青素對小鼠皮膚衰老模型的保護作用。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料和儀器 青海黑果枸杞原花青素粉末購自西安萬方生物科技有限公司;維生素E滴劑及D-半乳糖粉末購自北京索萊寶科技有限公司;長波黑斑效應紫外線(UVA)+中波紅斑效應紫外線(UVB)紫外線光療儀購自南京卡知電子科技有限公司;UVB和UVA型UV輻照度監(jiān)視器購自臺灣路昌電子企業(yè)公司;HE染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;Weigert彈力纖維染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;IX71型Olympus倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司;Trizol RNA提取液購自ambion公司;小鼠MMP-2、MMP-9、內(nèi)參β-actin的PCR引物購自華大基因公司;RT-PCR試劑盒及SYBR Green I嵌合熒光定量PCR 擴增試劑盒購自TaKaRa公司。

    1.2 動物分組 2016年10月—2017年12月,選取45日齡SPF級昆明種雌性小鼠50只,體質(zhì)量18~22 g,由西安交通大學動物實驗室提供,標準飼料飼養(yǎng)。采用隨機數(shù)字表法分為正常組(A組)、皮膚衰老模型組(B組)、皮膚衰老模型+維生素E滴劑組(C組)、皮膚衰老模型+低劑量黑果枸杞原花青素(D組)、皮膚衰老模型+高劑量黑果枸杞原花青素(E組),每組10只。

    1.3 造模、給藥方法

    1.3.1 造模 A組小鼠正常光照飼養(yǎng)。B組、C組、D組、E組小鼠采用4%硫酸鈉脫毛,脫毛區(qū)域為背部皮膚5 cm×5 cm,間隔10 d脫毛1次,每日頸背部皮下注射5% D-半乳糖10 ml/kg。B組、C組、D組、E組采用UVA+UVB紫外線光療儀于距小鼠約40 cm垂直高處照射,功率均40 W,隔日照射,照射前燈管預熱15 min,每次照射40 min,持續(xù)造模40 d(UVA總劑量89.4 J/cm2,UVB總劑量8.3 J/cm2)。造模成功的宏觀體貌的觀察指標為肉眼觀察B組、C組、D組、E組較A組小鼠背部皮膚光滑程度減低,皺紋增多等。

    1.3.2 給藥方法 造模第11天,A組、B組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃0.5 ml/d,C組給予維生素E滴劑灌胃0.5 ml/d,D組、E組給予黑果枸杞原花青素灌胃,劑量分別為50 mg·kg-1·d-1和 100 mg·kg-1·d-1,連續(xù)用藥 30 d。

    1.4 取材 造模第42天,5組小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉,快速剪取頸背部4 cm×4 cm大小的脫毛皮膚,仔細除去皮下多余脂肪,部分皮膚小心攤平后,放入10%甲醛溶液中固定用于病理組織學檢測,余皮膚冷凍于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

    1.5 實驗方法

    1.5.1 Weigert彈力纖維染色 標本于10%甲醛溶液中固定12 h后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片,進行Weigert彈力纖維染色。在光鏡(×40)下觀察各組標本真皮層厚度變化,在光鏡(×400)下觀察各組標本真皮層膠原纖維、彈力纖維的變化。

    1.5.2 RT-PCR法測定MMP-2、MMP-9的mRNA表達水平 取保存在-80 ℃冰箱中的皮膚組織50 mg,提取樣本皮膚組織的總RNA,測定濃度并定量后采用RT-PCR試劑盒完成反轉(zhuǎn)錄。取反轉(zhuǎn)錄后cDNA使用SYBR Green I嵌合熒光法進行PCR檢測。引物設(shè)計:內(nèi)參β-actin上游引物為5'-GAGTACAACCTTCTTGCAGCTC-3',下游引物為5'-CATACCCACCATCACACCCTG-3', 擴 增 長 度 198 bp;MMP-2上游引物為5'-TGGCACCACCGAGGACTATGAC-3',下游引物為5'-ACACCACACCTTGCCATCGTTG-3',擴增長度175 bp;MMP-9上游引物為5'-TGATTGACGACGCCTTTGCC-3',下游引物為5'-CCGCGACACCAAACTGGATG-3',擴增長度114 bp。采用2-ΔΔCt法計算MMP-2、MMP-9的mRNA表達水平。

    1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Weigert彈力纖維染色 光鏡(×40)下,肉眼可見B組較A組真皮層厚度明顯減小,C組、D組、E組較A組真皮層厚度稍增厚(見圖1)。光鏡(×400)下,肉眼可見B組較A組真皮層膠原纖維及彈力纖維缺失、排列紊亂、結(jié)構(gòu)松散,出現(xiàn)斷裂、卷曲,證明本次小鼠皮膚衰老模型造模成功;C組較B組可見纖維組織增多、網(wǎng)狀排列,仍可見斷裂、卷曲;D組、E組較B組、C組明顯可見新生纖維組織、排列整齊,斷裂、卷曲明顯減少,且E組較D組新生纖維更成熟(見圖2)。

    2.2 MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表 達 水 平 5組 小 鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。B組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達水平高于A組,D組、E組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達水平均低于B組,E組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達水平低于D組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表1)。

    表1 5組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達水平比較(±s)Table 1 Comparison of expression levels of MMP-2 mRNA and MMP-9 mRNA in 5 groups

    表1 5組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達水平比較(±s)Table 1 Comparison of expression levels of MMP-2 mRNA and MMP-9 mRNA in 5 groups

    注:與A組比較,aP<0.05;與B組比較,bP<0.05;與D組比較,cP<0.05

    組別 只數(shù) MMP-2 mRNA MMP-9 mRNA A組 10 0.56±0.10 0.42±0.11 B組 10 1.00±0.00a 1.00±0.00a C組 10 0.95±0.13 0.94±0.07 D組 10 0.76±0.08b 0.74±0.08b E組 10 0.52±0.06bc 0.48±0.12bc F值 13.703 17.697 P值 <0.001 <0.001

    3 討論

    皮膚衰老通常分為內(nèi)源性衰老和外源性老化。內(nèi)源性衰老又稱為時程性老化或自然衰老,是具有年齡依賴性的皮膚功能和結(jié)構(gòu)的老化。外源性老化又稱為皮膚光老化,紫外線照射是其最主要因素,其特征更主要在于膠原、彈性纖維的損傷及異常彈性纖維的沉積等[5]。青海所在的青藏高原地區(qū)具有高海拔、缺氧、強紫外線的環(huán)境特點,長期居住于此的人群更易加速皮膚衰老,引發(fā)多種皮膚疾病。尤其高原地區(qū)強紫外線輻射對皮膚造成曬傷、炎癥、抵抗力下降、氧化應激、過早衰老、癌癥等傷害[6]。但與此同時,青海地區(qū)因其獨特的生態(tài)環(huán)境孕育著其特有的植被資源。從天然植物中尋找高效、無害的天然抗老化成分已日漸成為學者們的研究熱點。原花青素被認為是有效的抗氧化劑,其營養(yǎng)及生物活性價值已得到國內(nèi)外學者的廣泛認可[7]。但目前,青海黑果枸杞原花青素對皮膚衰老的影響機制不詳。

    圖1 Weigert彈力纖維染色顯示各組小鼠皮膚真皮層厚度的變化(Weigert彈力纖維染色,×40)Figure 1 Weigert elastic fiber staining showed changes in dermal thickness of mice skin in each group圖2 Weigert彈力纖維染色顯示各組小鼠皮膚真皮層纖維組織的變化(Weigert彈力纖維染色,×400)Figure 2 Weigert elastic fiber staining showed the changes of dermal fibrous tissues of mice in each group

    本實驗小鼠皮膚衰老模型的建立通過采用D-半乳糖皮下注射聯(lián)合紫外線UVA、UVB照射,最大限度地模擬皮膚衰老過程。實驗結(jié)果顯示,B組較A組明顯可見皮膚真皮層厚度減小,膠原纖維及彈性纖維缺失、排列紊亂、結(jié)構(gòu)松散、斷裂、卷曲等皮膚衰老現(xiàn)象,故實驗造模有效。Weigert彈力纖維染色可見,經(jīng)維生素E滴劑治療后,真、表皮層變化不明顯,而50 mg·kg-1·d-1和100 mg·kg-1·d-1黑果枸杞原花青素均可減少皮膚真皮纖維變性、缺失,增加真皮層厚度,后者改變程度大于前者,證實黑果枸杞原花青素對于真皮層厚度、膠原纖維及彈性纖維再生的療效。

    膠原蛋白及彈性蛋白是存在于細胞外基質(zhì)(ECM)中維持皮膚彈性和強度的主要物質(zhì)[8]。而MMP是一組廣泛存在的Zn2+依賴性內(nèi)肽酶,MMPs 能降解絕大部分ECM成分,包括膠原蛋白和彈性蛋白,對ECM成分的動態(tài)重塑起著重要的作用[6,9-10]。同時,MMP被認為是光老化的參與因子,即使極低的紫外線輻射水平也能上調(diào)人體皮膚中的MMP活性[5]。因此,抑制劑直接抑制MMP的活性或通過減少MMP的表達來間接抑制可能是抵抗皮膚衰老的有效方法。MMP根據(jù)作用底物及結(jié)構(gòu)的不同分為五大類:膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素、膜型MMP、其他類型MMP[6]。其中,MMP-2及MMP-9均屬于明膠酶,通過降解ECM如變性膠原、基底膜結(jié)構(gòu)等來影響皮膚表、真皮層導致皮膚老化[11-12]。

    本實驗結(jié)果顯示,B組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達水平高于A組,表明本實驗的小鼠皮膚衰老模型中存在MMP的過度表達,造成細胞外基質(zhì)的過度降解,從而導致皮膚衰老。D組、E組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達水平均低于B組,E組小鼠MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表達水平低于D組,進一步證實了療效同藥物有關(guān),表明黑果枸杞原花青素可以通過較少MMP-2、MMP-9的過度表達來減少細胞外基質(zhì)的過度降解,從而發(fā)揮抵抗皮膚衰老的效果。

    綜上所述,黑果枸杞原花青素是通過影響皮膚真皮層厚度、纖維形態(tài)及MMP-2、MMP-9水平起到治療皮膚衰老的作用,從而證實青海黑果枸杞原花青素改善皮膚衰老的潛能,為青海黑果枸杞的開發(fā)、利用提供理論依據(jù)。

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