Notch信號(hào)通路配體Jagged1與DLL4在子癇前期孕婦胎盤組織中的表達(dá)及意義

王小艷 俞丁丁

子癇前期在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率為5%～10%，作為胎盤缺血性疾病，其病因復(fù)雜，嚴(yán)重影響患者妊娠結(jié)局[1]。目前，子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論，但子宮-胎盤血液循環(huán)障礙導(dǎo)致的胎盤缺血缺氧以及大量細(xì)胞因子被釋放進(jìn)入母體血液循環(huán)在該疾病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用已得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的公認(rèn)[2]。研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路能夠通過(guò)影響細(xì)胞增殖、分化和血管形成等活動(dòng)起到調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的作用，其同源配體Jagged1與DLL4更是與胎盤血管形成和發(fā)育密切相關(guān)[3]。但目前將胎盤組織中Jagged1與DLL4表達(dá)水平聯(lián)合檢測(cè)應(yīng)用于子癇前期患者的研究較少。本研究旨在探討Notch信號(hào)通路配體Jagged1與DLL4在子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)及其意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2013年5月至2017年3月在本院接受剖宮產(chǎn)術(shù)分娩的子癇前期孕婦73例，年齡21～38（29.3±4.2）歲，孕 1～3（1.8±0.6）次。所有患者均符合《妊娠期高血壓疾病診治指南》[4-5]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除合并慢性高血壓、糖尿病、甲狀腺功能異常、其他重要臟器器質(zhì)性病變者。根據(jù)病情，將73例孕婦分為中輕度子癇前期孕婦37例（輕度組）和重度子癇前期孕婦36例（重度組）。另選取同期正常妊娠且接受剖宮產(chǎn)術(shù)分娩的孕婦 35 例作為對(duì)照組，年齡 19～39（27.2±3.5）歲，孕 1～2（1.6±0.7）次?；颊吲c對(duì)照組年齡、孕次比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 3組孕婦均在剖宮產(chǎn)胎盤娩出后，立即從胎盤母體面中央切取2塊約1cm3大小的胎盤組織，注意避開(kāi)梗死區(qū)與鈣化區(qū)。1塊胎盤組織保存于無(wú)菌凍存管中，放置于-80℃冰箱內(nèi)保存；另1塊胎盤組織固定于4℃40g/L多聚甲醛溶液中。

1.2.2 胎盤組織中Jagged1、DLL4表達(dá)定位 采用免疫組化SP法。取固定胎盤組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶使用3%過(guò)氧化氫清除。分別加入稀釋度為1∶50的Jagged1抗人一抗和DLL4抗人一抗（美國(guó)Santa Cruz公司），陰性對(duì)照以PBS代替一抗。操作步驟嚴(yán)格按照SP法說(shuō)明書進(jìn)行。使用病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.3 胎盤組織中Jagged1、DLL4蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。取無(wú)菌凍存管中胎盤組織剪碎，將預(yù)冷裂解液加入進(jìn)行冰上勻漿裂解1h。4℃下14 000g離心5min，取上清液，測(cè)定蛋白濃度。取50μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，待分離后置于硝酸纖維素膜，分別加入小鼠抗人Jagged1抗體（1∶1 000）和小鼠抗人DLL4抗體（1∶800），4℃下孵育過(guò)夜。洗膜，加二抗，室溫下孵育1h。采用ECL法顯色，以GAPDH作為內(nèi)參?；叶确治鍪褂肂andscan 5.0軟件包。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用 Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎盤組織中Jagged1、DLL4表達(dá)定位 在對(duì)照組（圖 1a-b）、輕度組（圖 1c-d）、重度組（圖 1e-f）孕婦胎盤組織中，Jagged1主要表達(dá)于絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，DLL4主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞。

圖1 胎盤組織中Jagged1、DLL4表達(dá)定位（a：對(duì)照組胎盤組織中Jagged1表達(dá)定位；b：對(duì)照組胎盤組織中DLL4表達(dá)定位；c：輕度組胎盤組織中Jagged1表達(dá)定位；d：輕度組胎盤組織中DLL4表達(dá)定位；e：重度組胎盤組織中Jagged1表達(dá)定位；f：重度組胎盤組織中DLL4表達(dá)定位；免疫組化SP法，×400）

2.2 3組孕婦胎盤組織中Jagged1、DLL4蛋白表達(dá)水平比較 3組孕婦胎盤組織中Jagged1、DLL4蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。對(duì)照組孕婦胎盤組織中Jagged1、DLL4蛋白表達(dá)水平均高于輕度組和重度組，輕度組孕婦胎盤組織中Jagged1、DLL4蛋白表達(dá)水平均高于重度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表 1。

3 討論

Notch信號(hào)通路是單次跨膜蛋白家族的一員[6]，在脊柱動(dòng)物中廣泛存在，并在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡和血管形成中扮演重要角色[7]。由于其功能缺失會(huì)導(dǎo)致果蠅翅膀發(fā)生缺刻（Notchs），故得此命名。在哺乳動(dòng)物中，該信號(hào)通路由同源受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch 4）、同源配體（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2）和CSL-DNA結(jié)合蛋白所組成。當(dāng)相鄰細(xì)胞相互激活該通路時(shí)，細(xì)胞Notch受體與配體相結(jié)合，并釋放活化的Notch區(qū)域，該區(qū)域被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合后對(duì)DNA起到調(diào)控作用[8]。

表1 3組孕婦胎盤組織中Jagged1、DLL4蛋白表達(dá)水平比較

近年來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)Notch家族蛋白在胎盤組織中的表達(dá)與胎盤形成密切相關(guān)，尤其是同源配體Jagged1與DLL4[9]。Jagged1在正常胎盤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞和絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中呈高表達(dá)，而DLL4則在正常胎盤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈高表達(dá)。Santa等[10]研究發(fā)現(xiàn)胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Jagged1能夠促進(jìn)血管出芽，與胎盤血循環(huán)過(guò)程密切相關(guān)。Grochowski等[11]研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期孕婦胎盤組織中DLL4表達(dá)有所降低，推測(cè)DLL4具有抑制血管增生和促進(jìn)血管成熟的作用，與Jagged1在血管形成方面具有一定拮抗作用，兩者共同促進(jìn)胎盤血管生成發(fā)育。

本研究中，使用免疫組化SP法對(duì)胎盤組織中Jagged1與DLL4表達(dá)進(jìn)行定位，結(jié)果與Spinner等[12]研究一致，提示Jagged1、DLL4與胎盤血管發(fā)育有關(guān)。胎盤富含血管，新生的血管網(wǎng)是胎盤正常發(fā)育和宮內(nèi)胎兒正常生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。而子癇前期孕婦胎盤血管的形成和增殖被抑制，使胎盤局部血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)育受限，導(dǎo)致血管數(shù)量下降、發(fā)育不足，產(chǎn)生胎盤血管重塑，從而導(dǎo)致胎盤缺血缺氧[13]。Otti等[14]研究發(fā)現(xiàn)Jagged1與DLL4在正常妊娠胎盤組織中具有較高的相關(guān)性，并可能存在動(dòng)態(tài)平衡，前者增加新生血管數(shù)量，而后者則抑制無(wú)功能血管的過(guò)度增殖，并使其功能成熟。而本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組孕婦比較，輕度組和重度組孕婦胎盤組織中Jagged1與DLL4蛋白表達(dá)水平均有不同程度下降，提示子癇前期孕婦胎盤組織中存在Jagged1與DLL4表達(dá)失衡，而該失衡導(dǎo)致的新生血管發(fā)育不足可能與子癇前期的發(fā)生有密切聯(lián)系。

綜上所述，子癇前期患者胎盤組織中Notch信號(hào)通路配體Jagged1與DLL4表達(dá)失衡，與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展有一定聯(lián)系，但具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。兩者聯(lián)合檢測(cè)有望為子癇前期的防治提供新的靶點(diǎn)。