百草枯中毒患者肺部抗菌肽LL-37和細(xì)胞因子的變化

譚 丹，曾小琴，徐 偉，周人杰

（陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院：1急診科，2呼吸科，重慶 400037)

百草枯（paraquat）在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，作為一種快速滅草劑具有較強(qiáng)的毒性，由于其屬于高效能接觸型除草劑，內(nèi)吸作用強(qiáng),時(shí)常發(fā)生百草枯中毒事件，當(dāng)前尚無一種有效的治療方法[1]。百草枯中毒患者會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部損傷、纖維化[2]，且百草枯急性中毒的患者病死率，可達(dá)到80%。然而其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。近年來，LL-37以及Th細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-4、IL-17等）在肺部疾病的研究中越來越廣泛。LL-37是一種內(nèi)源性抗微生物肽，具有提高免疫力的生物學(xué)功能[3]。此外，同樣具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子可在內(nèi)源性或外源性刺激作用下誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生低分子蛋白[4]。因此，本研究的目的是對(duì)百草枯中毒患者肺部LL-37和Th細(xì)胞因子的狀態(tài)進(jìn)行研究。將本院急診科于2016年5月至2017年5月期間收治的10例百草枯中毒患者作為此次研究的實(shí)驗(yàn)組，另招募體檢10例健康人群為對(duì)照組，觀察兩組人群Th細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-4、IL-17）以及LL-37水平的變化情況。

1 資料和方法

1.1 資料

將本院急診科于2016年5月至2017年5月期間收治的10例百草枯中毒患者作為此次研究的實(shí)驗(yàn)組，其中男性有3例，女性有7例，年齡范圍14～59歲，平均年齡為（34±4.45）歲，服用劑量為35～200 mL，平均服用劑量為（52±6.39）mL。收集患者服藥后48 h靜脈血10 mL并儲(chǔ)存在抗凝管內(nèi)。所有樣本通過干冰運(yùn)輸，血漿和血清樣品在20 min內(nèi)1500r/min 4℃離心15 min。將LL-37分析所需的血漿樣品儲(chǔ)存在-70℃的聚丙烯管中。細(xì)胞因子分析所需的血清樣品儲(chǔ)存在-20℃。對(duì)照組為10例健康查體志愿者攝入相等劑量生理鹽水，其性別、年齡與實(shí)驗(yàn)組相比，沒有顯著差異，具有可比性（P＞0.05）。此次研究涉及的20名研究者均獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，每個(gè)提供血液的患者也在知情同意書簽字。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血?dú)夥治?/p>

由本院檢驗(yàn)科采用RAPIDPoint?400/405血?dú)夥治鰞x（血?dú)夥治鰞x編號(hào)：TG010708099）進(jìn)行處理。

1.2.2 使用固相酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)量LL-37的水平

根據(jù)說明書，將樣品和標(biāo)準(zhǔn)物在包被有識(shí)別抗人LL-37的小鼠單克隆抗體的微量滴定孔中37℃溫育2 h，使用R﹠D Systems提供即用型試劑盒。將與鏈霉親和素-過氧化物酶綴合的生物素化示蹤抗體用于結(jié)合人LL-37。綴合的鏈霉親和素-過氧化物酶與底物和四甲基聯(lián)苯胺反應(yīng)，并且在加入草酸后停止酶反應(yīng)。用分光光度計(jì)在450nm測(cè)量吸光度。通過將吸光度值獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中LL-37的濃度。

1.2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)

使用人Th試劑盒（BMS817FF，eBioscience，Inc.，SanDiego，CA，USA）通過流式細(xì)胞術(shù)（FACSCalibur;BDBiosciences，F(xiàn)ranklinLakes，NJ，USA）,使用 Flow-CytomixTMPro 3.0軟件進(jìn)行分析。用特異性鼠源性單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，根據(jù)所測(cè)定的熒光強(qiáng)度和陽性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。首先制備全血細(xì)胞懸液，取肝素或EDTA抗凝全血(100 μmol/份)，置12×75 mm專用塑料試管中。每份加入20 μmol特異性熒光單抗，另一份加入熒光標(biāo)記的無關(guān)單抗作同型對(duì)照，室溫下避光染色15 min。置Q-PREP儀上溶解紅細(xì)胞、穩(wěn)定和固定白細(xì)胞，靜置5 min。之后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞因子水平。

1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及病理切片

重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買清潔級(jí)成年雄性SD大鼠60只，體重180～220 g（動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（渝）2016-0001）。3R原則給予人道關(guān)懷，隨機(jī)分為兩組。實(shí)驗(yàn)組采用一次性灌胃方式染毒10 mg/mL的百草枯溶液，染毒容量為5 mL/kg，對(duì)照組相同劑量生理鹽水灌胃，各組動(dòng)物均于染毒后6、12、18、24 h采用下腔靜脈穿刺取血約 5 mL，靜置20 min，離心后取血清，-70℃凍存,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)待檢測(cè),肺組織病理學(xué)的檢查:取下肺組織，置于體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液中固定，,石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0分析，統(tǒng)計(jì)圖用GraphPad Prism進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 百草枯中毒患者的臨床表現(xiàn)

收集的10例百草枯中毒患者大部分以呼吸系統(tǒng)癥狀為主要表現(xiàn)，10人次中發(fā)生咽痛10例（100%）、口腔灼傷10例（100%）、惡心嘔吐9例（90%）、腹部壓痛10例（100%）、胸悶胸痛4例（40%）、呼吸困難7例（70%）、血尿9例（80%）、休克3例（30%）、頭痛3例（30%）、昏迷2例（20%）。

2.2 百草枯中毒患者動(dòng)脈血?dú)夥治鲎兓?/h3>

由表1結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,其PO2、PCO2、pH值以及碳酸氫鹽（HCO3-）顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 百草枯中毒患者動(dòng)脈血?dú)夥治鲎兓?/p>

2.3 百草枯中毒患者血清LL-37濃度和Th相關(guān)細(xì)胞因子水平

由圖1結(jié)果可知，與對(duì)照組（體檢10例健康人群血液樣本）相比較，實(shí)驗(yàn)組百草枯中毒患者的血清Th細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-4、IL-17）以及LL-37水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 兩組百草枯中毒患者血漿LL-37濃度和Th相關(guān)細(xì)胞因子水平

2.4 兩組大鼠LL-37水平隨時(shí)間變化情況

如圖2所示：6、12、18、24 h對(duì)照組LL-37水平變化差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組LL-37的水平隨時(shí)間增加，與對(duì)照組比較各時(shí)間點(diǎn)LL-37水平均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 兩組大鼠LL-37水平隨時(shí)間變化情況

2.5 實(shí)驗(yàn)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺外觀及HE染色

染毒后6 h大體肺出現(xiàn)水腫，鏡下肺泡擴(kuò)張稍充血（圖3A、a），12 h大體肺出現(xiàn)充血、水腫點(diǎn)灶出血，鏡下肺泡擴(kuò)張充血，肺泡間隔增寬，伴有炎性滲出液及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖3B、b）

24 h大體肺出現(xiàn)充血、水腫，廣泛出血，鏡下出現(xiàn)肺泡毛細(xì)血管的擴(kuò)張充血，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,肺泡腔內(nèi)蛋白水腫液的滲出，大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔彌漫增寬，出現(xiàn)彌漫性間質(zhì)纖維化樣改變（圖3C、c）。

圖3 實(shí)驗(yàn)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺HE染色病理切片

3 討 論

目前，急性百草枯中毒常常造成患者的肺部繼發(fā)性纖維化，嚴(yán)重者可致其死亡[5]。早期的病理特征顯示有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)從而造成肺實(shí)質(zhì)的變性壞死，細(xì)胞外基質(zhì)以及纖維結(jié)締組織增生常常出現(xiàn)在中毒的中、晚期，是一個(gè)病理性動(dòng)態(tài)變化的過程[6-7]。之前有研究顯示，在百草枯中毒幸存的患者中，肺部輕微損傷的患者在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)也表現(xiàn)為限制性功能損傷，最后也可能會(huì)引起不可逆的肺間質(zhì)纖維化[8]，對(duì)于患者的預(yù)后也有極大的影響[9-10]?？梢姲俨菘葜卸痉尾坷^發(fā)性纖維化不僅決定該疾病的死亡率，還影響其預(yù)后，而肺部纖維化的發(fā)生和一系列的免疫過程密切相關(guān)，趨化免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)炎性促進(jìn)因子/抑制因子的分泌、協(xié)調(diào)天然免疫和獲得性免疫等功能，大量研究表明LL-37通過上述過程發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用，LL-37是cathelicidin肽Hcap-18的C末端切割產(chǎn)物，能直接殺死細(xì)菌、真菌和病毒，其表達(dá)調(diào)節(jié)失控也能引起多種疾病。目前還有研究證實(shí)LL-37通過MAPK信號(hào)通路調(diào)控IFNγ的表達(dá)，LL-37還通過激活樹突狀細(xì)胞調(diào)節(jié)T-輔助細(xì)胞分化。Th細(xì)胞活化和分化在免疫反應(yīng)中也至關(guān)重要，3種以上的Th細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，Th1細(xì)胞通過產(chǎn)生IFNγ調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。Th2細(xì)胞通過產(chǎn)生IL-4、IL-5以及IL-13調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，IL-17又能反過來促進(jìn)LL-37的表達(dá)，由此可見IFN-γ、IL-4、IL-17以及LL-37可能都參與到了草枯中毒肺部繼發(fā)性纖維化的免疫反應(yīng)過程中，并且IFN-γ、IL-4、IL-17的變化水平似乎受LL-37的調(diào)控，具有正相關(guān)性，上述各項(xiàng)因子也與肺損傷的水平呈正相關(guān)，前述實(shí)驗(yàn)也間接證明了這一點(diǎn)。

T細(xì)胞可在IL-17的刺激下激活，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生致炎因子，如IL-4、IL-7、IL-8等[10-11]。機(jī)體在炎癥早期的損傷時(shí)能夠及時(shí)的促使中性粒細(xì)胞的分泌，從而有效的阻止組織壞死，在介導(dǎo)中性粒細(xì)胞參與的過程中，LL-37起到了重要作用，有效介導(dǎo)前炎反應(yīng)[12]。此外，同時(shí)IFN-γ可誘導(dǎo)IL-6參與抗炎的作用。LL-37主要是中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生，具有多種活性作用[13-14]，其活性包括調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，趨化免疫細(xì)胞至損傷部位或感染部位，促進(jìn)再上皮化及損傷修復(fù)等[15-16]。

此次研究我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組百草枯中毒患者在48 h后會(huì)出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀。實(shí)驗(yàn)組患者與對(duì)照組人群相比，其PO2、PCO2、PH值以及碳酸氫鹽（HCO3-）顯著降低，說明百草枯中毒能夠造成患者低氧血癥、過度換氣以及代謝性酸中毒。實(shí)驗(yàn)組百草枯中毒患者的血清細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-4、IL-17）以及LL-37水平顯著較高，說明細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17以及LL-37可能都參與到了草枯中毒肺損傷過程中，并且可作為百草枯中毒所致肺部損傷的早期敏感指標(biāo)。然而，人體中毒是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過程，與它受毒物攝入量、救治時(shí)間與方式、患者本人情況等多種因素的影響。而在后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間進(jìn)展LL-37的水平也會(huì)逐漸升高，且與肺部損傷，炎癥反應(yīng)具有相關(guān)性，LL-37在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮重要功能。LL-37通過轉(zhuǎn)錄激活上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGFR)和誘導(dǎo)FPFL-1的表達(dá)，促進(jìn)纖維細(xì)胞以及氣道上皮細(xì)胞向損傷區(qū)域的遷移，并參與增殖與修復(fù)。另外LL-37通過EGFP和MAPK/ERK調(diào)節(jié)的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)單核吞噬系統(tǒng)促進(jìn)了肉芽組織的形成，參與損傷修復(fù)，這可能也是肺纖維化的病理基礎(chǔ)

4 結(jié)論

綜上，本研究認(rèn)為L(zhǎng)L-37以及Th細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-4、IL-17）參與了百草枯中毒所致肺部損傷，且升高時(shí)間較早，具有早期檢測(cè)意義；LL-37水平可能與中毒時(shí)間以及肺損傷程度呈正比，通過早期人為干預(yù)LL-37水平能否對(duì)緩解百草枯中毒甚至是肺纖維化程度，值得進(jìn)一步研究。