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    丹參中三萜酸的分離及其抗炎活性的研究*

    2019-05-18 02:05:56黃莉婷許瓊明楊世林高紅偉
    關(guān)鍵詞:三萜丹參酮培養(yǎng)箱

    黃莉婷,丁 昉,許瓊明,2,楊世林,2,高紅偉,3**

    (1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南寧 530020;2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院 蘇州 215123;3.廣西優(yōu)勢(shì)中成藥與民族藥開(kāi)發(fā)工程技術(shù)中心 南寧 530020)

    丹參Radix Salviae Miltiorrhizae是唇形科植物丹參的干燥根和根莖,它的主產(chǎn)地主要是在江蘇、山東、安徽、四川,大多數(shù)為栽培品;在春、秋二季采挖,除去它的莖葉、泥沙、須根,曬干。丹參最開(kāi)始被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品。它性微寒,味苦。歸心、肝經(jīng),具有活血通絡(luò)、祛瘀止痛、涼血消癰、清除心煩等功效,常用于治療心絞痛、冠心病及胸腹刺痛、經(jīng)閉痛經(jīng)等癥,入藥歷史悠久。《本草綱目》中記載,丹參活血,通心包絡(luò),治疝痛;《本經(jīng)》記載,丹參主治心腹邪氣,腸鳴幽幽如走水,寒熱積聚,破癥除瘕,止煩滿,益氣;《別錄》記載,丹參養(yǎng)血,去心腹痼疾結(jié)氣,腰脊強(qiáng)腳痹,除風(fēng)邪留熱,久服利人,具有“一味丹參,功同四物”的說(shuō)法[1,2]。丹參作為一種傳統(tǒng)中藥,長(zhǎng)期記載于《中國(guó)藥典》中,且成功被《美國(guó)藥典》收錄。丹參作為一個(gè)在臨床上被用了上千年的中藥,被開(kāi)發(fā)出很多產(chǎn)品,如復(fù)方丹參滴丸、丹參片、復(fù)方丹參片、復(fù)方丹參注射液、丹參舒心膠囊、丹參酮膠囊等,尤其是丹參復(fù)方滴丸是第一個(gè)進(jìn)入美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)臨床試驗(yàn)的復(fù)方中藥,具有十分重要的意義。

    圖1 三萜酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式

    早在20世紀(jì)30年代,就有國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)丹參的化學(xué)成分進(jìn)行了研究。丹參化學(xué)成分主要包括兩大類:一類是以丹參素(Propanoid acid)和丹酚酸(Salvianolic acid)為代表的水溶性成分,主要以丹酚酸A、B、C、D、E最為常見(jiàn)[3]。而且現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,這些丹酚酸化合物具有明顯的生物活性,尤其是丹酚酸B的生活性研究的最為廣泛且深入。其明顯具有抗心血管疾病[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]、治療糖尿病[6]、抗炎、抗氧化等藥理活性[7]。另一類是以丹參酮(Tanshinone)為代表的脂溶性成分[2,8,9],主要以丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I、二氫丹參酮I 最為常見(jiàn)。藥理活性研究表明,丹參酮具有明顯的生物活性,主要表現(xiàn)在抗炎[10]、抗腫瘤[11]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[12]、治療心血管疾病[13]等。三萜類成分如莫里斯酸、烏蘇酸等在唇形科鼠尾草屬植物中早已被分離得到[14]。其藥理活性亦有很多報(bào)道,主要體現(xiàn)在三萜酸對(duì)抗氧化、抗菌、抗腫瘤等方面的生物活性[14],對(duì)三萜酸抗炎活性研究報(bào)道很少。因此,本實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)丹參中三萜酸一類化學(xué)成分分離及其抗炎活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明,我們分離得到7 個(gè)三萜酸(圖1),他們都屬于本植物首次分離得到??寡谆钚匝芯勘砻鳎麄兌季哂辛己玫目寡谆钚?。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    半制備島津高效液相色譜儀(LC-20AB,SPD-20A,日本島津公司);C18分析色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國(guó)kromasil公司);CPA225D Sartotius電子天平(上海中殷醫(yī)療設(shè)備有限公司);核磁共振儀(TMS 內(nèi)標(biāo),Bruker AVANCE III600 型,德國(guó)布魯克公司);中壓柱色譜(填料為ODS,瑞士Buchi公司);CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo 公司);Biotek Synergy H1 酶標(biāo)儀(美國(guó)博騰公司);梅特勒-托利多電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

    1.2 材料

    化學(xué)試劑(分析純及色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);氘代試劑(德國(guó)Merck 公司);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek 公司);脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、Greiss 試劑(美國(guó)Sigma 公司);胎牛血清(FBS)及高糖培養(yǎng)基(DMEM)(美國(guó)Gibco 公司);TNF-α及IL-6 ELISA試劑盒(中國(guó)深圳欣博盛公司);RAW264.7細(xì)胞(美國(guó)ATCC)。丹參藥材購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng),經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院李笑然教授鑒定為丹參,藥材標(biāo)本保存于蘇州大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室(No.20151009-1)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 提取與分離

    將50 kg干燥丹參飲片用95%乙醇(100 L)加熱回流提取兩次,減壓濃縮至無(wú)醇味。分別用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取,減壓濃縮得到二氯甲烷部位濃縮液(5.2 kg),乙酸乙酯濃縮液(3.8 kg),正丁醇濃縮液(6.3 kg)。將二氯甲烷部位濃縮液(5.2 kg)經(jīng)減壓硅膠柱色譜(200-300目),石油醚-乙酸乙酯(9∶1,6∶1,3∶1,1∶1,0∶1)梯度洗脫得到五個(gè)部位Fr.1-Fr.5,合并Fr.3和Fr.4兩個(gè)部位。將合并的部分樣品用純甲醇溶解,用中壓色譜(MPLC)連接ODS 反相色譜柱分離,甲醇-水(1∶9,3∶7,5∶5,7∶3,9∶1)梯度洗脫,并結(jié)合SephadexLH-20凝膠色譜及半制備高效液相色譜(HPLC)進(jìn)一步分離,分離得到化合物1(45.6 mg),2(52.9 mg),3(62.3 mg),4(42.6 mg),5(39.1 mg),6(26.1 mg),7(51.0 mg)。并且這7個(gè)化合物都是從該植物中首次分離得到。

    2.2 Greiss試劑檢測(cè)化合物對(duì)NO釋放的影響

    將RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(FBS)高糖培養(yǎng)基(DMEM)中,放在含有5%CO2溫度為37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將2×104RAW264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞種在96 孔板中,然后將其培養(yǎng)在CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜,用不同濃度的化合物(60,30,15 μM)預(yù)處理細(xì)胞1 h后,加入LPS(1 μg·mL-1)共培養(yǎng)16 h,取上清液(80 μL)與Griess 試劑(80 μL)混合,在CO2培養(yǎng)箱避光孵育15 min,用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為540 nm檢測(cè)吸光度值。

    2.3 ELISA方法檢測(cè)TNF-α和IL-6

    將2×105RAW264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞種在24 孔板中,然后將其培養(yǎng)在CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜,用不同濃度的化合物(60,30,15 μM)預(yù)處理細(xì)胞1 h 后,加入LPS(1 μg·mL-1)共培養(yǎng)16 h,取上清液,按照酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒說(shuō)明書(shū),檢測(cè)化合物對(duì)炎癥因子:腫瘤壞死因子(TNF-α)及白介素-6(IL-6)的釋放情況。

    2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

    應(yīng)用Graphpad Prism 6.0 軟件中的單因素方差分析(One way-ANOVA)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較分析,所有藥理實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物1:白色無(wú)定型粉末(甲醇)。1H-NMR(C5D5N,600 MHz)δ:3.96(1H,m,H-2),3.48(1H,m,H-3),5.28(1H,s,H-12),2.25(1H,d,J=11.4 Hz,H-18),0.97(3H,s,H-23),0.87(3H,s,H-24),0.77(3H,s,H-25),0.97(3H,s,H-26),1.17(3H,s,H-27),0.80(3H,s,H-29),0.88(3H,s,H-30)。13C-NMR(C5D5N,125 MHz)δ:42.1(C-1),66.6(C-2),79.1(C-3),38.6(C-4),48.3(C-5),18.7(C-6),33.2(C-7),39.8(C-8),47.6(C-9),38.7(C-10),23.8(C-11),125.7(C-12),138.6(C-13),41.3(C-14),28.6(C-15),24.4(C-16),47.5(C-17),53.2(C-18),39.7(C-19),39.5(C-20),30.4(C-21),37.3(C-22),28.9(C-23),22.5(C-24),16.9(C-25),17.4(C-26),23.9(C-27),181.1(C-28),17.2(C-29),21.6(C-30)。其1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定其為2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid[15]。

    化合物2:白色無(wú)定型粉末(甲醇)。1H-NMR(C5D5N,600 MHz)δ:3.45(1H,d,J=9.5 Hz,H-3),4.26(1H,m,H-2),5.49(1H,br,s,H-12),1.28(3H,s,H-23),1.02(3H,s,H-24),1.06(3H,s,H-25),1.08(3H,s,H-26),0.98(3H,s,H-29)1.22(3H,s,H-27),0.95(3H,s,H-30)。13C-NMR(C5D5N,125 MHz)δ:47.9(C-1),69.0(C-2),83.4(C-3),39.6(C-4),55.9(C-5),18.2(C-6),33.8(C-7),48.8(C-8),48.7(C-9),38.9(C-10),23.9(C-11),122.6(C-12),144.3(C-13),42.8(C-14),28.8(C-15),24.2(C-16),46.9(C-17),42.3(C-19),31.5(C-20),34.8(C-21),33.9(C-22),29.8(C-23),17.5(C-24),17.8(C-25),17.9(C-26),26.5(C-27),180.1(C-28),33.9(C-29),24.2(C-30)。其1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定其為Maslinic acid[16]。

    化合物3:白色無(wú)定型粉末(甲醇)。1H-NMR(C5D5N,600 MHz)δ:3.48(1H,d,J=9.8 Hz,H-3),4.29(1H,m,H-2),5.62(1H,br,s,H-21)1.00(3H,s,H-23),1.09(3H,s,H-24),1.32(3H,s,H-25),1.78(3H,s,H-26),1.06(3H,s,H-27),0.77(3H,d,J=6.4 Hz,H-29),0.88(3H,d,J=6.0 Hz,H-30)。13C-NMR(125 MHz)δ:48.9(C-1),69.7(C-2),84.3(C-3),39.4(C-4),56.7(C-5),19.6(C-6),35.6(C-7),41.3(C-8),51.8(C-9),39.7(C-10),22.7(C-11),33.2(C-12),40.6(C-13),42.8(C-14),28.9(C-15),30.8(C-16),49.8(C-17),49.1(C-18),38.8(C-19),143.9(C-20),118.6(C-21),38.5(C-22),29.1(C-23),17.6(C-24),18.8(C-25),16.1(C-26),15.3(C-27),178.7(C-28),23.2(C-29),22.5(C-30)。其1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定其為Psiguanin A[17]。

    化合物4:白色無(wú)定型粉末(甲醇)。1H-NMR(C5D5N,600 MHz)δ:3.50(1H,m,H-2),2.89(1H,d,J=9.5 Hz,H-3),5.10(1H,br,s,H-12),0.86(3H,s,H-23),0.78(3H,s,H-24),0.79(3H,s,H-25),0.95(3H,s,H-26),1.02(3H,s,H-27),0.78(3H,d,J=6.4 Hz,H-29),0.88(3H,d,J=6.0Hz,H-30)。13C-NMR(C5D5N,125 MHz)δ:48.1(C-1),69.9(C-2),80.9(C-3),40.8(C-4),56.0(C-5),19.9(C-6),34.6(C-7),41.2(C-8),49.2(C-9),39.5(C-10),24.7(C-11),126.9(C-12),139.1(C-13),43.8(C-14),29.8(C-15),25.6(C-16),48.0(C-17),54.7(C-18),40.0(C-19),40.9(C-20),32.2(C-21),38.7(C-22),29.9(C-23),17.9(C-24),17,1(C-25),17.4(C-26),24.8(C-27),180.6(C-28),17.6(C-29),21.3(C-30)。其1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定其為2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid[18]。

    表1 三萜酸抑制LPS刺激RAW264.7細(xì)胞NO釋放

    化合物5:白色無(wú)定型粉末(甲醇)。1H-NMR(C5D5N,600 MHz)δ:3.45(1H,m,H-2),2.96(1H,d,J=9.5 Hz,H-3),5.15(1H,br,s,H-12),0.89(3H,s,H-23),0.85(3H,s,H-24),0.85(3H,s,H-25),0.99(3H,s,H-26),1.05(3H,s,H-27),0.82(3H,d,J=6.4Hz,H-29),0.92(3H,d,J=6.0Hz,H-30)。13C-NMR(C5D5N,125 MHz)δ:48.6(C-1),70.2(C-2),80.5(C-3),41.2(C-4),56.5(C-5),19.4(C-6),34.8(C-7),41.4(C-8),49.7(C-9),40.0(C-10),24.9(C-11),125.9(C-12),139.6(C-13),43.2(C-14),29.2(C-15),25.1(C-16),48.2(C-17),54.4(C-18),40.2(C-19),41.2(C-20),32.7(C-21),38.2(C-22),30.0(C-23),17.2(C-24),17,5(C-25),17.3(C-26),24.1(C-27),180.2(C-28),17.9(C-29),21.7(C-30)。其1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定其為2α-hydroxy ursolic acid[19,20]。

    化合物6:白色無(wú)定型粉末(甲醇)。1H-NMR(C5D5N,600 MHz)δ:3.52(1H,m,H-2),3.12(1H,d,J=9.0 Hz,H-3),5.65(1H,br,s,H-12),0.94(3H,s,H-23),0.93(3H,s,H-24),0.95(3H,s,H-25),0.99(3H,s,H-26),1.10(3H,s,H-27),1.25(3H,d,J=7.8 Hz,H-29),5.82(1H,br,s,H-30),5.94(1H,br,s,H-30)。13C-NMR(C5D5N,125 MHz)δ:47.1(C-1),70.8(C-2),80.9(C-3),41.5(C-4),56.7(C-5),19.9(C-6),34.1(C-7),41.9(C-8),50.1(C-9),40.6(C-10),25.5(C-11),126.3(C-12),139.1(C-13),43.8(C-14),29.6(C-15),25.8(C-16),48.5(C-17),54.8(C-18),39.1(C-19),154.8(C-20),31.7(C-21),38.6(C-22),16.9(C-23),17.8(C-24),17.9(C-25),17.8(C-26),24.5(C-27),178.9(C-28),18.1(C-29),105.4(C-30)。其1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定其為2α,3αdihydroxyursa-12,20(30)-dien-28-oic acid[18]。

    化合物7:白色無(wú)定型粉末(甲醇)。1H-NMR(C5D5N,600 MHz)δ:3.58(1H,m,H-2),3.12(1H,d,J=9.8 Hz,H-3),5.65(1H,br,s,H-12),3.67(1H,d,J =13.8 Hz,H-23),3.52(1H,d,J = 13.8 Hz,H-23),0.91(3H,s,H-24),0.96(3H,s,H-25),1.02(3H,s,H-26),1.12(3H,s,H-27),1.20(3H,d,J=7.8 Hz,H-29),5.78(1H,br s,H-30),5.82(1H,br s,H-30)。13C-NMR(C5D5N,125 MHz)δ:49.3(C-1),71.5(C-2),81.5(C-3),41.8(C-4),56.9(C-5),19.9(C-6),34.1(C-7),41.0(C-8),49.2(C-9),40.4(C-10),24.1(C-11),125.0(C-12),140.2(C-13),43.0(C-14),29.9(C-15),25.7(C-16),48.8(C-17),54.8(C-18),40.8(C-19),153.6(C-20),32.1(C-21),38.8(C-22),71.9(C-23),17.8(C-24),17.0(C-25),17.8(C-26),24.2(C-27),180.8(C-28),17.1(C-29),104.9(C-30)。其1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定其為2α,3αdihydroxyursa-12,20(30)-dien-28-oic acid[21]。

    3.2 化合物對(duì)NO釋放情況測(cè)定

    從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,我們發(fā)現(xiàn)7 個(gè)三萜酸都具有較好的抑制NO釋放作用(表1)。由于7個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式非常相似,所以他們體現(xiàn)出的抑制NO 釋放的活性基本一致,沒(méi)有明顯的差異性,也沒(méi)有體現(xiàn)出一定的構(gòu)效關(guān)系。

    3.3 化合物對(duì)炎癥因子TNF-α和IL-6釋情況測(cè)定

    從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,我們發(fā)現(xiàn)7 個(gè)化合物在高濃度的情況具有較好的抑制炎癥因子TNF-α及IL-6 的釋放(圖2)。7個(gè)化合物在高劑量時(shí)(60 μM)對(duì)TNF-α及IL-6的釋放具有明顯的抑制作用,在中劑量時(shí)(30 μM)體現(xiàn)出一定的活性,但是不明顯,低劑量(15 μM)幾乎沒(méi)有活性。

    4 討論

    丹參作為一味常見(jiàn)的活血化瘀類中藥,具有悠久的中醫(yī)臨床應(yīng)用歷史。目前,以關(guān)鍵詞“Danshen”或“丹參”在PubMed 或CNKI 分別搜到2 975 篇和48 998篇文章,可見(jiàn)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)丹參研究的非常廣泛且深入。有很多研究顯示,丹參具有很明顯的抗炎活性[22,23],尤其是丹酚酸和丹參酮抗炎效果及機(jī)制非常明確。丹酚酸和總丹參酮對(duì)各種炎癥模型的動(dòng)物都一定治療作用,如組織胺造模的血管通透性增加大鼠,蛋清、角叉菜膠或右旋糖酐造模的關(guān)節(jié)炎腫痛的大鼠,巴豆油、二甲苯造模耳腫脹的小鼠等[7]。其作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路,達(dá)到抑制溶酶體、炎癥因子(TNF-α,IL-1β,IL-6,NO,PGE2 等)釋放及中性粒細(xì)胞趨化性,起到減少炎癥滲出效果,從而達(dá)到抗炎效果[24]。本研究采用ELISA 方法檢測(cè)了7 個(gè)三萜酸對(duì)炎癥因子TNF-α和IL-6 的影響。結(jié)果顯示,7 個(gè)三萜酸都具有很好抑制炎癥因子釋放的作用。此外,本研究還采用Griess 試劑檢測(cè)NO 釋放,NO 在機(jī)體內(nèi)極不穩(wěn)定,容易生成NO2-,NO2-與Griess 試劑發(fā)生反應(yīng)生成重氮化合物[25]。因此,重氮化合物與NO成一定的線性關(guān)系,從而反應(yīng)了NO 的含量。NO 的生成主要是由一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)的作用下催化L-精氨酸生成的[26,27]。NOS 有三種形式eNOS、nNOS、iNOS。其中,eNOS主要調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生成NO,參與血管功能調(diào)控;nNOS 在神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)控NO 產(chǎn)生,參與細(xì)胞通訊及信息存儲(chǔ);iNOS 在誘導(dǎo)情況下產(chǎn)生NO,參與機(jī)體免疫與抗炎反應(yīng)等[26,27]。但是,本研究只是檢測(cè)NO 釋放情況,相關(guān)的iNOS 的活性及表達(dá)則沒(méi)有進(jìn)一步研究。綜上所述,本研究從丹參中分離鑒定了7個(gè)三萜酸,其中4個(gè)屬于本植物首次分離,豐富了丹參中的化學(xué)成分種類。此外,本研究初步探索了三萜酸抗炎活性,證實(shí)了7 個(gè)三萜酸都具有一定的抗炎活性,初步闡述了丹參發(fā)揮抗炎作用物質(zhì)基礎(chǔ),但是,其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入探索。

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