硫酸鹽還原菌分離及其處理煤礦酸性廢水工藝的實驗研究

董艷榮，狄軍貞，胡海洋，周君厚，阮 湞，孫雪瑩，趙中茜

(遼寧工程技術(shù)大學(xué) 土木工程學(xué)院，遼寧 阜新 123000)

1 研究背景

煤礦酸性廢水(acid mine drainage,AMD)具有高酸度、高硫酸鹽的特點，其中往往還含銅、鋅、鎳、鉛、鉻、鐵、汞、錳等多種毒性很強和濃度很高的重金屬離子[1]。若不經(jīng)修復(fù)處理直接排放，就會造成礦區(qū)周邊水資源大面積的酸污染和重金屬含量超標(biāo)[2]。煤礦酸性廢水對生態(tài)環(huán)境具有嚴(yán)重的危害性，已成為一個全球性的問題，受到人們普遍關(guān)注[3]。以硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)為優(yōu)勢菌種的微生物法處理煤礦酸性廢水具有成本低、效率高、環(huán)保等特點[4-5]。SRB可以利用有機碳異化還原SO42-生成H2S，H2S與水中溶解態(tài)的金屬離子反應(yīng)產(chǎn)生不溶于水的硫化物沉淀，從而有效治理SO42-和重金屬污染[6]。Wosiack等[7]研究表明厭氧條件下SRB能異化還原硫酸鹽，并有效沉淀重金屬離子。Miao Zhenyong等[8]分離得到S-7型硫酸鹽還原菌菌株對煤礦酸性廢水中Mn2+和Pb2+的去除率分別為93%和90%。SRB處理煤礦酸性廢水具有處理效率高、酸度提升能力強等優(yōu)點，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，礦區(qū)生態(tài)環(huán)境的綜合治理已經(jīng)成為一個極其重要且需迫切解決的課題。

因此，針對含F(xiàn)e2+煤礦酸性廢水直接排放污染水資源的問題，本試驗選用遼寧省阜新海州露天礦煤矸石堆放區(qū)周邊的污泥樣作為篩選樣品富集培養(yǎng)SRB，采用稀釋涂布-疊皿夾層厭氧培養(yǎng)法分離純化SRB，并對SRB生理生化特性進行分析，研究不同SRB接種量對煤礦酸性廢水中pH的修復(fù)、Fe2+和SO42-離子的去除情況。

2 材料和方法

2.1 實驗儀器

SY11/X-280A型手提式壓力蒸汽滅菌鍋、FA2104N型電子分析天平、100級超凈工作臺、THZ-92A型氣浴恒溫振蕩器、Q/TBCR1型752紫外可見分光光度計等。

2.2 培養(yǎng)基及模擬廢水的配制

培養(yǎng)基：K2HPO4，0.5 g；NH4Cl，1.0 g；CaCl2·2H2O，0.1 g；MgSO4·7H2O，2.0 g；Na2SO4，0.5 g；酵母膏，1.0 g；70%乳酸鈉溶液，4 mL；Fe(NH4)2(SO4)2，1.2 g；抗壞血酸，0.5 g；蒸餾水，1 000 mL；pH=7.0，121℃滅菌30 min(固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20 g瓊脂粉)。其中，F(xiàn)e(NH4)2(SO4)2和抗壞血酸不能進行高溫滅菌，用0.22 μm濾膜過濾除菌。除富集培養(yǎng)及分離純化的培養(yǎng)基中加入Fe(NH4)2(SO4)2外，其它試驗的培養(yǎng)基中均不添加Fe(NH4)2(SO4)2。

模擬廢水：試驗?zāi)M水樣根據(jù)遼寧省阜新市某煤礦采區(qū)礦井水的水質(zhì)實測數(shù)據(jù)，設(shè)定模擬的煤礦酸性廢水中含硫酸鹽濃度約為1 000 mg/L，鐵離子濃度約為55 mg/L，COD約為700 mg/L，pH值為5。

上述氯化鈣、硫酸鎂、氯化銨等試劑均為分析純，試驗用水為蒸餾水。

2.3 實驗及分析方法

2.3.1 SRB的富集培養(yǎng)、分離純化及菌種鑒定 將120 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基和5 mL煤矸石堆放區(qū)取樣的種泥樣添加到250 mL錐形瓶中，再添加10 mL已滅菌的液體石蠟起液封作用，用橡膠塞密封，置于35℃、150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行振蕩培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基變化情況。取500 μL稀釋度分別為1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的SRB菌懸液，采用稀釋涂布-疊皿夾層法進行固體分離，將分離得到的單一SRB轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)。針對分離得到SRB菌株進行革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色(銀染法)，利用油鏡觀察拍片，進行菌株初步鑒定。

2.3.2 溫度、pH值對SRB生長的影響 采用單因素試驗法探究溫度、pH值對SRB生長的影響，每個試驗樣品做3個重復(fù)，以培養(yǎng)液的光密度間接表示SRB數(shù)量，以相同條件下未接種SRB的培養(yǎng)基作為空白對照，振蕩培養(yǎng)一定時間后取適量液體用分光光度計測OD600值。

(1)溫度對SRB生長的影響：按6%的接種量將SRB接種到pH=7的等量培養(yǎng)基中，將試驗樣品分別置于25℃、28℃、31℃、34℃和37℃的培養(yǎng)箱中以105 r/min進行振蕩培養(yǎng)，一定時間后取適量液體測OD600值。

(2)pH值對SRB生長的影響：按6%的接種量將SRB接種到pH值分別為5、6、7、8、9的等量培養(yǎng)基中，將試驗樣品置于34℃、105 r/min的培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，一定時間后取適量液體測OD600值。

2.3.3 SRB的生長曲線 按6%的接種量將SRB接種到已滅菌的培養(yǎng)基中，將接種好的樣品置于34℃、105 r/min的培養(yǎng)箱中進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后取適量液體用分光光度計測OD600值，試驗做3個重復(fù)。

2.3.4 SRB最佳生長條件正交試驗設(shè)計 試驗選定溫度、pH和碳源3個因素，采用L9(33)正交表(表1)安排試驗。按6%的接種量將SRB接種到培養(yǎng)基中，將接種好的樣品放置在相應(yīng)溫度下、105 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后分別取適量液體測定OD600值。

表1 正交試驗因素與水平

2.3.5 SRB處理煤礦酸性廢水 用SRB處理煤礦廢水時向錐形瓶中添加400 mL煤礦廢水，并添加100 mL培養(yǎng)基來補充SRB生長所需的C、N、P元素，控制SRB的接種量分別為0、5%、10%、15%、20%，最后加入10 mL石蠟液封并用橡膠塞密封，置于34℃、105 r/min進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后分別測定水樣中SO42-和Fe2+的含量并計算去除率。其中，SO42-采用鉻酸鋇分光光度法測定、Fe2+采用鄰菲啰啉分光光度法測定、pH采用玻璃電極法測定[9]。離子去除率公式為：

去除率=(c0-ct)/c0×100%

(1)

式中：c0為接種當(dāng)天測得的初始離子濃度，g/L；ct為SRB接種第t天后的剩余離子濃度，g/L。

3 結(jié)果與討論

3.1 富集培養(yǎng)及分離純化SRB

圖1為不同密封條件下SRB培養(yǎng)情況比照。由圖1知，添加液體石蠟、塞橡膠塞的培養(yǎng)基在t=7 d時出現(xiàn)培養(yǎng)基變黑現(xiàn)象，且打開橡膠塞有臭雞蛋氣味。培養(yǎng)基變黑的原因是培養(yǎng)基中含有Fe(NH4)2(SO4)2，當(dāng)培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)出SRB時，SRB還原SO42-生成H2S，F(xiàn)e2+與H2S反應(yīng)生成FeS黑色沉淀，黑色沉淀可作為培養(yǎng)出SRB的標(biāo)志，H2S有臭雞蛋氣味[10]。而未加石蠟、塞棉塞的培養(yǎng)基變化不明顯。因此，后續(xù)試驗以添加液體石蠟和塞橡膠塞的試驗方法作為保證SRB振蕩培養(yǎng)時隔絕氧氣影響的措施。

采用稀釋涂布-疊皿夾層法分離純化SRB，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，固體培養(yǎng)8 d后稀釋度為10-2的SRB固體培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑色、單一的SRB菌落，其他稀釋度的固體培養(yǎng)基中出現(xiàn)單一SRB菌落效果均不理想。選取單一SRB菌落移至液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d后可見液體培養(yǎng)基變黑且打開塞子時有臭雞蛋氣味，即得到分離純化后的SRB。

針對分離得到SRB菌株進行革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色(銀染法)，利用油鏡觀察拍片，進行了菌株初步鑒定。由圖3可知，SRB菌株為革蘭氏陰性，生長形態(tài)為卵圓形。該SRB菌株有芽孢和單極生鞭毛。因此，初步鑒定該菌株為脫硫葉菌屬。

(1#、2#、3#為石蠟+橡膠塞，4#、5#為未添加石蠟+棉塞)

圖2 SRB的分離純化

圖3 革蘭氏染色照片(×1600)

3.2 溫度、pH值對SRB生長的影響

3.2.1 溫度對SRB生長的影響 在其他初始條件相同的條件下，考察溫度對SRB生長的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25、28、31、34和37℃時SRB均能生長，但生長繁殖速度存在不同。當(dāng)培養(yǎng)溫度為34℃時48 h內(nèi)測得OD600最大值為0.824，SRB生長狀態(tài)最好；當(dāng)培養(yǎng)溫度為28、31和37℃時SRB菌體的增加量沒有34℃時明顯且培養(yǎng)溫度為25℃時SRB菌體數(shù)量變化不明顯。這說明SRB生長的最適溫度為34℃，高溫或低溫都會抑制SRB的生長。該結(jié)果與程健明等[11]的研究結(jié)果相一致，其研究表明，中溫SRB最適生長溫度在28～38℃。

圖4 溫度對SRB生長的影響

3.2.2 pH值對SRB生長的影響 pH值對SRB生長的影響見圖5。培養(yǎng)基初始pH值對SRB生長的影響是通過影響H+與細(xì)胞中的酶相互作用而間接影響菌體活動[10]。由圖5可知，初始pH值為7和8時SRB菌體數(shù)量增加量較大。其中，初始pH值為7的培養(yǎng)基培養(yǎng)到48 h時，OD600值為0.729，是48 h內(nèi)出現(xiàn)的最大值且還具有繼續(xù)增大的趨勢，說明SRB最適生長的pH為7。該結(jié)果與譚向東等[12]的研究相一致，其研究發(fā)現(xiàn)，新疆油田回注水中的SRB有較廣的pH值生長范圍，且pH值為6.0～8.0區(qū)間是SRB的最佳pH值生長區(qū)間，在pH值小于6時，隨著pH值的降低SRB的菌株數(shù)量將減少。由圖5還可看出，當(dāng)SRB的培養(yǎng)基初始pH為5時SRB菌體的數(shù)量也有增加，這說明SRB能夠適應(yīng)偏酸性的環(huán)境，可用于去除煤礦酸性廢水中的離子。研究發(fā)現(xiàn)，SRB的耐酸性在pH =5～7之間[12]，當(dāng)初始pH為4～7時，SRB具有活性且對硫酸鹽的去除率隨著pH的升高而增加[13]。

圖5 pH值對SRB生長的影響

3.3 SRB的生長曲線

SRB的生長曲線見圖6。由圖6可知，SRB的生長曲線是典型的“S”型生長曲線。培養(yǎng)0～16 h處于停滯期，SRB在適應(yīng)新的培養(yǎng)條件，SRB生長緩慢且菌種增加量??；16～40 h處于對數(shù)期，SRB菌種活性較高，SRB菌種數(shù)量增加較快，適合用于處理煤礦酸性廢水。該菌種與付坤等[15]分離的SRB菌種相比，OD600達到最大值時所需的時間相對較短，從修復(fù)廢水的角度分析，該菌種縮短了其適應(yīng)新環(huán)境的培養(yǎng)周期。

圖6 SRB的生長曲線

3.4 正交試驗分析

L9(33)正交試驗結(jié)果如表2和3所示。

表2 正交試驗結(jié)果分析表

表3 正交試驗方差分析

通過對L9(33)正交試驗結(jié)果進行方差分析，得出各因子對SRB生長影響都不顯著，本試驗誤差的自由度相對較小，使正交試驗檢驗結(jié)果的靈敏度有所降低，從而在檢驗結(jié)果上掩蓋了考察碳源、pH和溫度3個因素的顯著性。導(dǎo)致正交試驗結(jié)果不顯著的原因也可能是不同碳源因素下選取的碳源濃度不適宜，導(dǎo)致SRB菌種活性降低，掩蓋了正交試驗結(jié)果的顯著性。從表3得出各因子對SRB生長影響的大小順序是：碳源>pH>溫度。直觀地從表2中選擇平均數(shù)大的水平A2B2C3為最優(yōu)組合即溫度為34℃、pH值為7、碳源為70%乳酸鈉組合成SRB最佳生長條件。

3.5 SRB對含F(xiàn)e2+煤礦酸性廢水的去除效果

3.5.1 SRB對煤礦酸性廢水pH的修復(fù)效果 不同SRB接種量對煤礦酸性廢水pH的修復(fù)效果見圖7。由圖7可以看出，SRB接種第1～3 d時廢水pH值迅速上升，第4～5 d時廢水pH的變化趨于穩(wěn)定。其中，添加5%、10%、15%和20%SRB菌液的煤礦酸性廢水培養(yǎng)5 d后pH由5分別提高到6.54、6.78、6.85和6.88。SRB還原硫酸鹽和催化氧化有機碳的同時使液體的pH值升高[16]，將煤礦酸性廢水的pH由5提高到7左右，有利于加速SRB新陳代謝，促進煤礦酸性廢水中SO42-和Fe2+的去除。

圖7 不同SRB接種量對煤礦酸性廢水pH的修復(fù)

3.5.2 SRB對煤礦酸性廢水中SO42-的去除效果 不同SRB接種量對煤礦酸性廢水中SO42-的去除效果見圖8。由圖8可以看出，隨著SRB處理時間的延長，SRB對煤礦酸性廢水中SO42-的去除率不斷提高，說明SRB異化還原廢水中SO42-的能力逐漸增強。SRB接種第1～3 d對煤礦廢水中SO42-的去除效果明顯提高。接種第5 d時，接種量為10%、15%和20%的樣品對煤礦酸性廢水中SO42-的去除率均大于74%，而接種量為5%的樣品對煤礦廢水中SO42-的去除率僅為38.68% 。這說明菌液接種量較少時接種量對SO42-的去除效果影響較大。本研究分離的SRB按10%接種量接種到廢水中時，對SO42-的去除率為74.71%。杜剛等[17]研究表明，分離得到的5株SRB還原硫酸鹽的能力有較大差異，對SO42-的去除率分別為44.69%、33.56%、52.05%、48.05%和88.83%。與上述學(xué)者分離的SRB相比，本研究分離的SRB還原硫酸鹽的能力高于其分離的4株SRB，低于其分離的1株SRB，產(chǎn)生差異的原因可能是菌株自身還原能力以及修復(fù)體系初始pH值不同造成的。

圖8 不同SRB接種量對煤礦酸性廢水中SO42-的去除效果

3.5.3 SRB對煤礦酸性廢水中Fe2+的去除效果 不同SRB接種量對煤礦酸性廢水中Fe2+的去除效果見圖9。由圖9可以看出，隨著去除時間的延長，SRB對煤礦酸性廢水中Fe2+的去除率不斷提高，SRB接種第1～3 d時對Fe2+的去除效果增加明顯，第4 d后去除效果增加幅度較小，接種第5 d時廢水中的Fe2+幾乎全部去除。其中，接種5%、10%、15%和20%SRB對煤礦酸性廢水中Fe2+的去除率分別為94.09%、99.18%、99.86%和99.89%。由SRB的生長曲線可知SRB接種后的16～40 h處于對數(shù)期，SRB菌種活性較高，故接種第1～3 d時對Fe2+的去除效果增加明顯。此外，蔣永榮等[18]研究發(fā)現(xiàn)，初始Fe2+濃度在低濃度范圍內(nèi)可以促進SRB的生長。SRB對廢水中Fe2+的去除效果明顯，且SRB接種量對Fe2+的去除效果影響不大。SRB去除廢水中鐵離子的機理可能有以下3個方面：(1)SRB通過代謝作用，異化還原硫酸鹽生成H2S，H2S又與Fe2+反應(yīng)生成FeS沉淀；(2)SRB代謝活動可以產(chǎn)生堿性，提高了酸性廢水的pH值，使Fe2+形成Fe(OH)2沉淀；(3)SRB代謝分泌到細(xì)胞外的胞外物和細(xì)胞膜表面帶負(fù)電對鐵離子的生物絮凝及靜電吸附作用[19]。

已有研究數(shù)據(jù)顯示，余水靜等[20]應(yīng)用SRB在溫度30℃、HRT=8 d、COD/SO42-=1.6、進水SO42-濃度為2.3 g/L、進水pH=4.5的條件下，采用上流厭氧反應(yīng)器運行24 d后，硫酸根平均除去率為75.35%，鐵離子的去除率為88.87%。而本研究分離的SRB菌種在接種5 d后對SO42-的去除率與以上學(xué)者相近，F(xiàn)e2+的去除率卻提高到99.18%。產(chǎn)生SO42-去除效果差異不大，而Fe2+去除效果提高的原因，可能是在還原等量硫酸鹽的條件下，本研究分離的SRB代謝產(chǎn)生堿度更高。

圖9 不同SRB接種量對煤礦酸性廢水中Fe2+的去除效果

4 結(jié) 論

(1)經(jīng)富集培養(yǎng)、稀釋涂布-疊皿夾層法分離純化得到的SRB的最適生長溫度為34℃，高溫或低溫都會抑制SRB的生長；最適pH為7，且SRB能夠適應(yīng)pH為5的偏酸性環(huán)境，可用于去除煤礦酸性廢水中的離子；SRB的生長曲線是典型的“S”型生長曲線，培養(yǎng)16～40 h時處于對數(shù)期，SRB菌種活性較高。

(2)L9(33)正交試驗確定SRB的最佳生長條件為：溫度為34℃、pH值為7、碳源為70%乳酸鈉，各因子對SRB生長影響的大小順序是：碳源>pH >溫度。

(3)接種5%、10%、15%和20%SRB對煤礦酸性廢水中的Fe2+和SO42-均有去除效果，綜合比較，在接種10%SRB時對煤礦酸性廢水中離子去除效果較好且用菌量較少，接種時間為5 d時對SO42-和Fe2+的去除率分別為74.71%和99.18%。

(4)本研究分離得到SRB的OD600達到最大值時所需的時間相對較短，且能夠適應(yīng)偏酸性的煤礦酸性廢水環(huán)境，對廢水中SO42-的去除率相對較高，同時，對Fe2+的去除率可達到99.18%。這說明本研究分離的SRB菌種更適宜應(yīng)用到處理含F(xiàn)e2+煤礦酸性廢水的工藝中，為礦區(qū)微生物修復(fù)含F(xiàn)e2+煤礦酸性廢水污染的技術(shù)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。