河北地區(qū)中國荷斯坦牛DGAT1 基因多態(tài)性與泌乳性狀遺傳效應分析

王思偉，王學清，石少輕，馬亞賓，王昆,3

（1.河北省農林科學院糧油作物研究所，石家莊 050000；2.河北省畜牧良種工作站，石家莊 050000；3.河北省牛種質資源技術創(chuàng)新中心，石家莊 050000）

乙酰輔酶A∶二酰甘油酰基轉移酶（Acyl CoA∶diacylglycerol acyltransferase，DGAT1）是由 DGAT1基因編碼的一種完整的細胞膜酶，其主要功能是在脂肪細胞甘油三脂合成反應的最后步驟起催化作用，也是合成甘油三脂的唯一關鍵酶[1]。DGAT1在機體組織中普遍存在，特別是在脂肪、乳腺、小腸、睪丸和皮膚中表達[2]，在腸道中的脂肪吸收、脂蛋白組裝、血漿中的甘油三酯濃度調節(jié)[3]、脂肪細胞中的脂肪貯存[4]、肌肉中的能量代謝[5]以及乳脂合成、禽蛋及卵母細胞的形成[6]等過程中發(fā)揮著重要作用。

牛的DGAT1基因位于牛14號染色體的端粒區(qū)[7]，序列長8.6Kb，由17個外顯子和16個內含子組成，其mRNA序列由245bp的5’UTR、1 470bp的編碼序列和275bp的3’UTR構成，編碼的蛋白質為489個氨基酸[8]。研究發(fā)現(xiàn)，牛DGAT1基因第8外顯子中存在一個K232A變異位點。研究者們認為，該位點的突變是14號染色體上影響奶牛乳脂率的QTL效應的分子機制[7,8]，并于2004年得到了驗證[9]。此后其他實驗室以DGAT1為候選基因在不同的奶牛群體進行了研究，并得到相似結論[10～12]。Kaupe[13]等人對分布于世界五大洲37個普通牛和瘤牛品種的分析發(fā)現(xiàn)，DGAT1基因中K232A位點的等位基因K在不同品種中的分布不同，在奶牛群體中的分布頻率差異很大。

候選基因與數(shù)量性狀的連鎖關系通常在某一群體或特定群體的特定世代中出現(xiàn)，且與該群體的特殊遺傳背景相作用。因此，為了將候選基因遺傳效應應用于畜禽經濟性狀的標記輔助選擇中，就需要在不同或同一品種的不同群體中不斷進行驗證，甚至在同一群體中也要經過多個世代的驗證[14]。河北省是我國重要的奶牛養(yǎng)殖區(qū)域，2016年全省奶牛存欄約180.6萬頭，奶類總產量達448.0萬t，居全國第三位。但是至今尚未有關于河北地區(qū)荷斯坦牛DGAT1基因與奶牛泌乳性狀的研究報道。本研究旨在探討河北地區(qū)荷斯坦牛DGAT1基因的遺傳多態(tài)性及其與主要泌乳性狀的關系，為奶牛分子標記輔助選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物血樣的采集

870頭中國荷斯坦母牛血樣分別采自河北省石家莊鹿泉、藁城、正定、唐山蘆臺縣和保定的5個牛場，產奶性狀表型記錄和系譜記錄由河北省畜牧良種工作站DHI中心提供。每頭牛采集血液5mL，即刻放入抗凝離心管中，上下?lián)u動，編號，于冰盒中保存，回到實驗室后采用血液基因組DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術有限公司，北京）提取奶?；蚪MDNA，于-20℃冷凍保存。

1.2 引物合成與PCR擴增

根據牛DGAT1基因的已知序列（GenBank登錄號：AJ318490），采用Oligo 6.0軟件對其K232A突變側翼序列設計引物，上、下游引物序列分別為5′-GTCAACCTCTGGTGCCGAGA-3′和5′-GGAAGGAAGCAAGCGGACAGT-3′，預期擴增片段為484bp。

PCR反應體系為25μL：其中12.5μL MasterMix；上游引物和下游引物各0.5μL；基因組DNA模板1.0μL，加超純水10.5μL至25μL。PCR反應程序為：95℃預變性5min；94℃變性45 s，68℃退火30s，72℃延伸40s，34個循環(huán)；72℃延伸10min；降溫至4℃保存。擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳（120v，30min）檢測。

1.3 RFLP分析

酶切反應總體積為10μL：EaeⅠ限制性內切酶0.5μL、10×Buffer 1.0μL、PCR產物8.5μL，37℃條件下酶切1h。酶切產物用2%瓊脂糖凝膠電泳（160v，40min）分離，EB染色，紫外燈下觀察拍照，記錄結果。

1.4 測序分析

經PCR-RFLP分析后，對不同基因型隨機選擇2個個體的PCR產物進行回收純化, 送至北京六合華大基因科技有限公司進行正反方向直接測序。

1.5 數(shù)據統(tǒng)計與分析

1.5.1 基因型頻率和等位基因頻率的計算

基因型頻率 = 基因型個體數(shù)/測定群體總數(shù)

等位基因 A 的頻率：p(A) = (D+1/2H)

等位基因 T 的頻率：q(T)= (R+1/2H)

D、H、R 分別為AA、TA和TT基因型頻率。

遺傳雜合度( He) 計算：

式中： pi為群體中第i個等位基因的頻率，m為等位基因數(shù)。

有效等位基因數(shù)（Ne）計算：

式中： pi為群體中第i個等位基因的頻率，n 為等位基因數(shù)。

多態(tài)信息含量( PIC) 計算：

式中 ：pi和 pj分別為群體中第 i 和第 j 個等位基因的頻率，m 為等位基因數(shù)。

皮爾遜卡方檢驗：

式中：O 代表群體中每個基因型的觀測數(shù)目，E 代表假定 Hardy-Weinberg 平衡定律成立時每個基因型的期望個體數(shù)。

1.5.2 基因型與泌乳性能相關性分析

產奶性狀和基因型的關聯(lián)分析采用SAS(8.02)軟件的MIXED過程進行，動物模型為：

式中：y為產奶性狀表型記錄，μ為群體平均值，F(xiàn)是場次效應，T是胎次效應，G是基因型效應，a是加性遺傳效應，E是隨機殘差效應。

1.5.3 等位基因加性效應、顯性效應和替代效應

等位基因加性效應的計算：

等位基因顯性效應的計算：

等位基因替代效應的計算：

式中：p為A等位基因頻率，q為K等位基因頻率，KK、AA和KA分別為各基因型的表型最小二乘均值。

等位基因替代效應的顯著性檢驗利用線性回歸模型（SAS），通過泌乳性狀對K等位基因拷貝數(shù)（0、1、2）的回歸來計算，分別將基因型KK、KA和AA定義為2、1和0。

2 結果與分析

2.1 DGAT1基因K232A位點的遺傳多態(tài)性分析

以中國荷斯坦?；蚪MDNA為模板，通過設計引物對DGAT1基因K232A位點進行擴增，獲得1條484bp的片段。采用限制性內切酶EaeⅠ消化后顯示3種基因型：484bp；484、320、164bp和320、164bp，分別命名為KK、KA和AA。PCR-RFLP的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示。經統(tǒng)計，基因型KK、KA和AA的頻率分別為0.0402、0.9276和0.0321；等位基因K和A的頻率分別為0.5040和0.4960。多態(tài)信息含量PIC為0.37（0.25＜PIC＜0.5），為中度多態(tài)。雜合度He為0.4990，有效等位基因數(shù)Ne為2.0000，該位點在群體中極顯著地偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.01）。

圖1 DGAT1 基因 K232A 位點 PCR-RFLP 擴增

2.2 DGAT1基因K232A位點擴增片段的測序

序列分析結果表明：KK基因型的核苷酸序列與GenBank中DGAT1基因的序列（GenBank登錄號：AJ318490）一致，AA基因型在第10 433和10 434bp位點發(fā)生了AA-GC雙堿基突變。測序結果見圖2。

圖2 不同基因型的測序結果

2.3 DGAT1基因K232A位點與泌乳性狀關聯(lián)分析

DGAT1基因的K232A位點不同基因型對乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量、305d產奶量5個產奶性狀的最小二乘均值及標準誤見表1。由結果可知，該突變位點極顯著影響乳脂率（P＜0.01），顯著影響305d產奶量（P＜0.05），對乳脂量、乳蛋白率和乳蛋白量的影響不顯著（P＞0.05）。多重比較結果表明，KK基因型的乳脂率極顯著高于KA和AA基因型（P＜0.01）；KA和AA基因型的305天產奶量顯著高于KK基因型（P＜0.05）；KK基因型的乳脂量和乳蛋白量均低于其他兩個基因型，但未達顯著水平（P＞0.05）；AA和KA基因型之間無顯著差異（P＞0.05）。等位基因替代效應顯示，每個A等位基因替代K等位基因會導致乳脂率降低0.151%，乳脂量提高5.345kg，乳蛋白率降低0.02%，乳蛋白量提高8.973kg，305d產奶量提高324.515kg。A等位基因是305d產奶量的優(yōu)勢等位基因，K等位基因是乳脂率的優(yōu)勢等位基因。

表1 DGAT1基因K232A位點不同基因型與泌乳性狀的關聯(lián)分析

3 討論

3.1 等位基因頻率的差異

國外許多學者均對K232A變異位點的基因頻率進行了檢測分析。Kaupe等[13]通過對五大洲13個國家共37個品種進行檢測發(fā)現(xiàn)，K等位基因的頻率在奶牛品種中差異較大。Schennink等[15]檢測了荷蘭1 779頭荷斯坦牛，其等位基因A和K的頻率分別為0.6和0.4。Oikonomou等[15]檢測的希臘497頭荷斯坦牛中，A和K基因頻率分別為0.38和0.62，且無AA基因型。Spelman等[10]檢測發(fā)現(xiàn)，K 等位基因在新西蘭1 527頭荷斯坦牛中的頻率為0.6，在113頭愛爾夏牛中的頻率為0.22，在1 053頭娟姍牛中的頻率是0.88。Pareek等[16]研究顯示，K等位基因在波蘭105頭人工授精公牛中的頻率為0.6，在139頭青年公牛中的頻率為0.68，在213頭黑白花母牛中的頻率為0.48。Naslund等[17]發(fā)現(xiàn)K等位基因在瑞典紅牛中頻率為0.09。我國學者對該位點也進行了大量研究。結果顯示，K232A變異位點在我國不同地區(qū)不同群體奶牛中的分布頻率差異較大（見表2），大部分地區(qū)的奶牛群體中KK基因型頻率低于0.1[18～24]，但新疆[19]、甘肅[25]、貴州[26]的中國荷斯坦牛，內蒙古的澳系、新系荷斯坦牛[20]以及江西吉安西雜母牛[27]的KK基因型頻率較高。本研究對河北地區(qū)5個牛場的870頭中國荷斯坦牛進行檢測分析，結果顯示，K和A等位基因的基因頻率分別為0.5040和0.4960，在河北奶牛群體的分布較為平衡，與賈晉[14]、周利華[19]、張曉東[20]等研究結果一致；KA基因型的頻率為0.9276，為優(yōu)勢基因型，與賈晉等[14]研究結果相似，但是，純合基因型在河北地區(qū)奶牛群體中的分布極少。該位點處于中度多態(tài)，遺傳改良潛力較好，等位基因分布均勻，極顯著偏離H-W平衡，說明該位點在群體中存在非自然選擇。綜合分析表明，該位點在河北荷斯坦牛群體中處于被非自然選擇因素破壞了平衡的狀態(tài)，是適合應用于遺傳選育的候選位點。

表2 我國不同地區(qū)不同奶牛品種DGAT1基因遺傳多態(tài)性

3.2 K232A位點遺傳效應的差異

Grisart等[8]和Winter等[7]研究發(fā)現(xiàn)，DGAT1基因的K232A位點突變對新西蘭和荷蘭黑白花奶牛的乳脂性狀有重大影響。Winter等[7]對荷斯坦牛、瑞士褐牛和德系西門塔爾牛，Thaller等[11]對德國荷斯坦牛，Weller等[12]對以色列荷斯坦牛的研究也報道了相似的結果。Pareek等[16]對波蘭荷斯坦牛的研究表明，K223A 突變對牛奶中低的脂肪含量和高的蛋白含量有顯著作用。我國學者對DGAT1基因K232A位點不同突變類型與不同地區(qū)不同品種奶牛的泌乳性狀的關聯(lián)分析結果表明，該基因突變對不同奶牛群體泌乳性能的影響不盡相同。賈晉[14]、毛永江[24]、馬彥男[25]等人的分析結果表明，K等位基因是影響奶牛乳脂率的優(yōu)勢基因，A等位基因是影響產奶量和乳蛋白率的優(yōu)勢基因，與國外大部分研究結果相同。但是，部分學者認為該位點并非對乳脂率、乳蛋白率和產奶量均有影響，殷驥[23]等人研究認為該位點對乳蛋白率無顯著影響，周利華[19]、張曉東[20]的分析結果則顯示該位點對產奶量無顯著影響，而鄒榮婕[28]則認為該位點僅影響奶牛的乳脂率，對乳蛋白率、產奶量無顯著影響。此外，還有學者得到了相反的研究結果，李崢[22]的研究結果表明，K等位基因是乳蛋白率的優(yōu)勢基因，而張馭偉[26]則認為A等位基因是乳脂率的優(yōu)勢基因。本研究結果表明，K232A突變位點對乳脂和305d產奶量有顯著影響，對乳脂量、乳蛋白率和乳蛋白量無顯著影響。K等位基因是乳脂率的優(yōu)勢等位基因，A等位基因是305d產奶量的優(yōu)勢等位基因，與殷驥等的研究結果一致。環(huán)境條件、奶牛品系雜交和奶牛選育背景等可能是造成結果差異較大的原因。

DGAT1是甘油三脂合成過程中唯一的關鍵酶，對動物機體脂肪代謝、脂類在組織中的沉積起著重要作用。作為影響奶牛泌乳性狀的候選基因之一，明確該基因的遺傳多態(tài)性及其對經濟性狀的影響，進行分子標記輔助選擇，對提高奶牛產奶性狀，加快育種進程，實現(xiàn)優(yōu)質品種改良具有深遠意義。近年來，隨著GWAS等技術的應用[30,31]及相關研究的不斷深入，研究者們認為DGAT1基因除了影響奶牛的產奶量、乳脂率和乳蛋白率外，對奶牛乳糖率[32]、乳脂肪酸[33～35]以及空懷天數(shù)、輸精次數(shù)、初配年齡等繁殖性狀[15,36]也有顯著影響。今后應圍繞該基因對乳成分及繁殖性狀的影響展開研究。

4 結論

本研究針對DGAT1 基因 K232A 位點，采用 PCRRFLP法分析了河北省鹿泉、藁城、正定、唐山蘆臺縣和保定的5個地區(qū)共870頭中國荷斯坦牛的遺傳多態(tài)性，利用混合動物模型對該突變位點與乳脂率、乳蛋白率、乳脂量、乳蛋白量及305d產奶量5個泌乳性狀進行了遺傳效應分析。研究結果表明，該位點基因型及基因頻率分布與我國其他地區(qū)荷斯坦牛的差異較大。DGAT1 基因 K232A 位點突變對河北地區(qū)中國荷斯坦牛泌乳性狀有較大的遺傳效應，可用于其泌乳性狀的分子標記輔助選擇，但有關該位點遺傳效應差異及突變對乳成分和繁殖性狀方面的影響值得進一步深入研究。