水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體al14的表型分析及基因定位

胡婷婷，何彎彎，王友霜，王健康，丁成偉，郭榮良，吳玉玲，趙軼鵬

摘要：本研究從徐稻3號群體中獲得1個(gè)可穩(wěn)定遺傳的白化轉(zhuǎn)綠自然突變體al14，與野生型相比，突變體al14出苗后白化，三葉期后轉(zhuǎn)綠，白化葉的葉綠素含量顯著降低。整個(gè)生育期除抽穗期和株高外，其他農(nóng)藝性狀和野生型無顯著差異。經(jīng)透射電鏡觀察，白化葉片中大部分葉綠體發(fā)育異常，類囊體膜數(shù)量變少，片層結(jié)構(gòu)松散;遺傳分析結(jié)果表明，該白化轉(zhuǎn)綠突變性狀由1對隱形核基因控制。利用突變體al14/9311的F2群體中白化表現(xiàn)明顯個(gè)體精細(xì)定位，最終將突變基因al14定位到第1染色體短臂標(biāo)記al14-3和al14-10之間，物理距離為100.5 kb。測序發(fā)現(xiàn)突變體在該區(qū)間內(nèi)編碼線粒體底物ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因Os01g0265200終止密碼子前插入了18 bp堿基，編碼氨基酸發(fā)生改變。結(jié)合葉綠體發(fā)育、葉綠素合成等相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果和表型，推測該基因可能調(diào)控幼苗葉綠體發(fā)育。

關(guān)鍵詞：水稻;白化轉(zhuǎn)綠突變體;葉綠體發(fā)育;線粒體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)子

中圖分類號：S511文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2021）06-1361-09

Phenotypic analysis and gene mapping of a green-revertible albino mutant al14 in rice

HU Ting-ting，HE Wan-wan，WANG You-shuang，WANG Jian-kang，DING Cheng-wei，GUO Rong-liang，WU Yu-ling，ZHAO Yi-peng

（Xuzhou Institute of Agricultural Sciences of the Xuhuai District of Jiangsu Province， Xuzhou 221121， China）

Abstract：In this study， a green-revertible albino mutant al14 was obtained from Xudao 3 population. Compared with wild type， mutant al14 exhibited albinotic leaves at seedling stage and the leaves gradually turned green after three-leaf stage， and the chlorophyll content of albinotic leaves decreased significantly. Except plant height and heading date， there was no significant difference in other agronomic traits between wild type and al14 mutant. With a transmission electron microscopy， defective chloroplasts with less thylakoid were observed in albinotic leaves of al14 mutant， and the lamellar structure was loose. The results of genetic analysis indicated that the phenotype of a114 was controlled by a pair of recessive nuclear gene. The gene al14 was mapped to a 100.5 kb region between the InDel markers al14-3 and al14-10 on chromosome 1. The gene Os01g0265200 encoding mitochondrial ADP/ATP transporter was identified as a candidate gene based on a 18 bp insertion in the front of termination codon， this insertion resulted in altered transcription. Combined with the results of real-time fluorescence quantitative PCR and phenotype of genes associated with chloroplast development and chlorophyll biosynthesis， it is speculated that al14 may be the key gene for regulating chloroplast development at early seedling stage.

Key words：rice;green-revertible albino mutant;chloroplast development;mitochondrial ADP/ATP transporter

綠色植物有機(jī)物的合成、能量的轉(zhuǎn)化和儲存主要通過葉綠體的光合作用來實(shí)現(xiàn)[1]。葉色變異大多伴隨葉綠體的發(fā)育異常、葉綠素合成分解代謝紊亂，影響生物產(chǎn)量。水稻中的葉色突變大部分為無意義的突變[2]，突變后生物量降低，生育期延遲，性狀退化，品質(zhì)和產(chǎn)量也未能得到提升[3]。但是，隨著功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，葉色突變體為研究植物的葉綠體發(fā)育[4]、光合作用[5]、核質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]、光形態(tài)建成[7]等提供了優(yōu)異材料，同時(shí)葉色突變體容易被識別，也可用于作物的新品種選育[8-10]。

水稻的白化突變多在苗期就可識別，根據(jù)對生長發(fā)育的影響，可分為白化轉(zhuǎn)綠和白化致死2種類型，其來源十分廣泛，人工誘變、組織培養(yǎng)和自發(fā)突變均可產(chǎn)生白化突變。目前水稻中已有大量白化突變體被報(bào)道，這些材料的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了植物的光合作用和核、質(zhì)功能基因組等方面的研究。已有研究結(jié)果表明，白化轉(zhuǎn)綠突變體v1、v2、v3、st1和tsv都對溫度敏感，V1編碼RNA結(jié)合蛋白NUS1，冷脅迫條件下該蛋白質(zhì)積累增多，調(diào)節(jié)葉綠體RNA的轉(zhuǎn)錄，并在早期葉綠體發(fā)育過程中促進(jìn)質(zhì)體遺傳系統(tǒng)的建立[11]。V2編碼鳥苷酸激酶，參與葉綠體分化通路中的質(zhì)核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或（和）質(zhì)體翻譯，低溫下質(zhì)體翻譯被嚴(yán)重抑制[12];V3和ST1分別編碼核糖核酸還原酶的大亞基、小亞基，基因突變后，核糖核酸還原酶的活性下降，葉綠體DNA復(fù)制受損，低溫下尤其顯著[13]。低溫下，TSV通過和PEP轉(zhuǎn)錄復(fù)合物亞基OsTrxZ互作，保護(hù)幼苗早期葉綠體發(fā)育[14]。alr是一個(gè)白葉矮化突變體，基因ALR編碼1個(gè)dCMP脫氨酶（OsDCD），參與并維持細(xì)胞中的DNA損傷修復(fù)并調(diào)控細(xì)胞周期[15]。naal1是1個(gè)窄葉白化突變體，NAAL1可調(diào)節(jié)H3K4和H3K27的甲基化并參與調(diào)節(jié)葉片形態(tài)發(fā)生，此外該基因參與植物生長素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及信號傳導(dǎo)[16]。asl2、alm1和las1均為幼苗白化死亡突變體，其葉綠體發(fā)育都存在缺陷。ASL2編碼葉綠體50S核糖體蛋白，該蛋白質(zhì)對水稻葉綠體的發(fā)育至關(guān)重要[17]，ALM1編碼1個(gè)鐵超氧化物歧化酶，和TSV一樣，也能與OsTrxz互作形成復(fù)合物，參與葉綠體的合成，影響植物的光合作用[18];LAS1突變后影響葉綠體基因的編輯效率，編碼的LAS1蛋白能在體內(nèi)與MORF蛋白互作，影響葉綠體核糖體的發(fā)育，在葉綠體的發(fā)育中起著極為重要的作用[19]。除了這些幼苗白化突變體外，還有一些特殊的白化突變體被鑒別，如持續(xù)陰雨天下使植株由綠苗轉(zhuǎn)白的突變體abci8，該突變基因OsABCI8/OsABCI7編碼1個(gè)保守的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與水稻中鐵等過渡金屬元素的轉(zhuǎn)運(yùn)、葉綠體發(fā)育與葉綠素合成[20]，同時(shí)能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧穩(wěn)態(tài)，維持類囊體膜的完整與穩(wěn)定[21];wltt是1個(gè)使植株移栽后葉色轉(zhuǎn)白條紋的突變體，移栽后新生葉片中的大部分葉肉細(xì)胞不含葉綠體，色素含量顯著降低，光合速率下降[22]。

本實(shí)驗(yàn)室從徐稻3號的群體中發(fā)現(xiàn)1株能穩(wěn)定遺傳的自然突變體al14，al14出苗后白化，三葉期后轉(zhuǎn)綠，整個(gè)生育期除抽穗期和株高外，其他農(nóng)藝性狀和野生型相比無顯著差異。遺傳分析結(jié)果表明，該白化轉(zhuǎn)綠突變性狀由1對隱形核基因控制。通過精細(xì)定位將控制白化轉(zhuǎn)綠性狀基因al14定位到第1染色體標(biāo)記al14-3和al14-10之間，物理距離為100.5 kb，測序發(fā)現(xiàn)突變體該區(qū)間內(nèi)編碼線粒體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)子基因Os01g0265200發(fā)生了插入突變，導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)生改變。熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果表明，該基因的突變影響了葉綠體發(fā)育、光合系統(tǒng)形成相關(guān)基因的表達(dá)。這些結(jié)果為進(jìn)一步開展葉色標(biāo)記育種和高光效分子育種提供了理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與田間試驗(yàn)

al14來源于徐稻3號群體的1個(gè)自然突變，經(jīng)過連續(xù)多代自交，al14的白化轉(zhuǎn)綠表型在江蘇和海南都能穩(wěn)定遺傳。野生型和突變體正季種植于徐州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)試驗(yàn)示范基地，5月上旬播種，四葉期移栽，單本栽插， 移栽密度25 cm×15 cm，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種植80株。分別在出苗后3 d、6 d、12 d觀察表型并測定色素含量。成熟期分別調(diào)查野生型和突變體中長勢一致的30個(gè)單株，調(diào)查其株高、有效穗、千粒質(zhì)量、結(jié)實(shí)率、穗長等農(nóng)藝形狀，取平均值，利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

1.2色素含量測定

分別取出苗后6 d、12 d、18 d長勢一致的野生型和突變體完全展開葉，參照Wu等[23]的方法測定葉片單位鮮質(zhì)量的色素含量：取新鮮葉片去掉兩端和中脈，剪碎，稱量約0.01克樣品，加入5毫升95%的乙醇提取色素，避光浸提24～48 h，期間多次搖晃 至葉片色素完全析出，12 000 r/min下離心5 min，取上清液用分光光度計(jì)測定665 nm、649 nm和470 nm下的吸光值，計(jì)算色素含量，5次重復(fù)。

1.3葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

取出苗后8 d的野生型和al14相同部位長寬約為1～2 mm的葉片，抽真空固定于戊二醛溶液（體積分?jǐn)?shù)為2.5%，pH為7.2）中6 h，磷酸緩沖液沖洗后在1%的鋨酸中固定4 h，隨后用體積分?jǐn)?shù)梯度為30%～80%的乙醇溶液脫水，包埋、聚合。修塊、切片及醋酸鈾染色后置于透射電鏡下觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)。

1.4總RNA的提取及Real-time PCR

用RNA提取試劑盒（貨號DP432，天根生化科技有限公司產(chǎn)品）提取出苗后8 d的野生型和突變體葉片的總RNA。反轉(zhuǎn)錄采用大連寶生物公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript Reverse Transcriptase kit）進(jìn)行，內(nèi)參基因?yàn)锳ctin1（Os03g0729800）。PCR反應(yīng)體系為20.0 μl：1.6 μl cDNA，10.0 μl SYBR Premix Ex Taq II （2×），正反引物各0.8 μl （10 μmol/L），6.8 μl ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)儀器為ABI PRISM 7900HT，參考Livak等[24]的方法分析Real-time PCR試驗(yàn)結(jié)果。3次重復(fù)。

1.5突變性狀的遺傳分析和遺傳群體構(gòu)建

配制al14和徐稻3號的正反交組合，F(xiàn)2群體種植于徐州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)試驗(yàn)示范基地，出苗8 d后分別統(tǒng)計(jì)F2群體中正常表型和白化表型單株數(shù)，計(jì)算分離比，進(jìn)行卡方測驗(yàn)和遺傳分析。

配制al14和9311雜交組合，單株收種。正季種植F2群體，出苗后8 d標(biāo)記白化表型明顯的個(gè)體，三葉一心時(shí)提取DNA進(jìn)行基因初定位和精細(xì)定位。

1.6突變基因定位

采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取DNA。挑出覆蓋全基因組且多態(tài)性良好、均勻分布在水稻12條染色體上的InDel標(biāo)記148對，用F2白化表現(xiàn)明顯個(gè)體進(jìn)行連鎖分析和基因精細(xì)定位。參照Shi等[25] 的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，銀染顯色，拍照讀取結(jié)果。用10個(gè)F2白化表現(xiàn)明顯個(gè)體篩選全部為al14帶型的分子標(biāo)記確定連鎖位點(diǎn)，用92個(gè)白化表現(xiàn)明顯單株驗(yàn)證該位置。增加定位群體，在包含目標(biāo)基因的區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位。根據(jù)http：//ricevarmap.ncpgr.cn/提供的9311和日本晴間的Indel差異位點(diǎn)及引物設(shè)計(jì)工具開發(fā)引物，比對結(jié)合位點(diǎn)，篩選多態(tài)性后用于精細(xì)定位。

2結(jié)果與分析

2.1突變體al14的表型

al14是1個(gè)自然突變體，與野生型相比，突變體在出苗后就出現(xiàn)白化表型，三葉期后逐漸轉(zhuǎn)綠（圖1）。除白化表型外，抽穗前突變體生長發(fā)育和野生型基本一致，但抽穗后整體發(fā)育遲緩，al14的株高極顯著降低，抽穗期偏遲，有效穗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量與野生型相比無明顯變化（表1）。

A：出苗后3 d;B：出苗后6 d;C：出苗后12 d;D：成熟期。

2.2野生型徐稻3號和突變體al14的色素含量

研究結(jié)果表明，色素含量的改變會引起葉片顏色的改變，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們分別測定了出苗后6 d、12 d和18 d野生型和突變體新出葉片的色素含量。結(jié)果表明，與野生型相比，出苗后6 d、12 d，突變體al14葉片中的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量都極顯著降低 （圖2A、圖2B）;出苗后18 d，突變體al14的葉片完全轉(zhuǎn)綠，轉(zhuǎn)綠后的色素含量與野生型無顯著差異（圖2C）。這表明色素含量的改變導(dǎo)致了突變體al14的白化表型。

A：出苗后6 d;B：出苗后12 d;C：出苗后18 d。**表示野生型與突變體al14之間差異極顯著（P<0.01）。

2.3葉綠體超微結(jié)構(gòu)

類嚢體膜是葉綠素合成的場所，為進(jìn)一步探明突變體al14在亞細(xì)胞水平上的葉綠體發(fā)育情況，明確葉片白化形成的原因，我們觀察了野生型和突變體al14出苗后8 d和18 d新出葉片葉綠體的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，野生型的葉綠體結(jié)構(gòu)完整，類囊體膜數(shù)量豐富，片層結(jié)構(gòu)堆積規(guī)則，且致密清晰;葉綠體也含有連續(xù)閉合完整膜（圖3A、圖3B）。突變體al14白化葉片中，極少數(shù)細(xì)胞中的葉綠體正常發(fā)育，但大部分細(xì)胞中的葉綠體出現(xiàn)不連續(xù)的空泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)容物混沌，類囊體膜數(shù)量變少，片層結(jié)構(gòu)松散，葉綠體雙層膜結(jié)構(gòu)發(fā)育不全（圖3C、圖3D）。轉(zhuǎn)綠后突變體al14的葉綠體結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，基粒片層結(jié)構(gòu)豐富，排列有序（圖3E、圖3F）。

2.4突變體al14中葉綠素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)

白化葉片中，色素含量發(fā)生了變化，因此我們利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)分析了葉綠素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平。與野生型相比，突變體中的HEMA（編碼谷氨酸-tRNA還原酶）、CHLM（編碼鎂離子原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶）表達(dá)量極顯著下調(diào)（圖4），CHLH（編碼鎂螯合酶H亞基）、CHLG（編碼葉綠素合成酶）表達(dá)量極顯著上調(diào);HEMB（編碼5-氨基酮戊酸脫水酶）、HEMC（編碼原脫氨酶）、HEME（編碼尿卟啉原Ⅲ脫羧酶）、CAO（編碼葉綠素a氧化酶）以及CHLI（編碼螯合酶I亞基）的表達(dá)量無顯著差異。

2.5突變體al14中光合系統(tǒng)和葉綠體發(fā)育相關(guān)途徑基因的表達(dá)

葉綠體發(fā)育異常往往會改變綠色植物光合系統(tǒng)和葉綠體發(fā)育相關(guān)途徑基因的表達(dá)，為探明突變體al14早期的白化葉片中相關(guān)基因的表達(dá)量是否發(fā)生了改變，我們利用qRT-PCR分析了相關(guān)基因的表達(dá)（圖5）。結(jié)果顯示，突變體al14中編碼光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ蛋白質(zhì)復(fù)合物的psaA、psaB、psbA，以及編碼捕光葉綠素a/b結(jié)合基因Cab2的表達(dá)量均極顯著低于野生型;但編碼NADH脫氫酶的基因ndhB和ndhD以及編碼轉(zhuǎn)運(yùn)RNA聚合酶的基因rpoB的表達(dá)量沒有明顯變化。

A、B：野生型出苗后8 d葉綠體超微結(jié)構(gòu);C、D：突變體al14出苗后8 d葉綠體超微結(jié)構(gòu);E、F ：轉(zhuǎn)綠后al14葉綠體超微結(jié)構(gòu)。A、C標(biāo)尺為2 μm，B標(biāo)尺為1 μm，D、E圖標(biāo)尺為500 nm， 圖F標(biāo)尺為200 nm。

HEMA：谷氨酸-tRNA還原酶基因;HEMB：5-氨基酮戊酸脫水酶基因;HEMC：原脫氨酶基因;HEME：尿卟啉原Ⅲ脫羧酶基因;CHLI：螯合酶I亞基基因;CHLD：鎂離子螯合酶D亞基基因;CHLM：鎂離子原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶基因;CHLH：鎂螯合酶H亞基基因;CHLG：葉綠素合成酶基因;CAO：葉綠素a氧化酶基因。**表示同一基因表達(dá)量野生型與突變體al14之間差異顯著（P<0.01）。

psaA：編碼光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）合成亞基的基因;psaB：編碼光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ） 合成亞基的基因;psbA：編碼光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）核心復(fù)合物的基因;ndhB：編碼NADH脫氫酶ndh家族的基因;ndhD：編碼NADH脫氫酶ndh家族的基因;rpoB：編碼轉(zhuǎn)運(yùn)RNA聚合酶rpo家族的基因;rpoA：編碼RNA聚合酶rpo家族的基因;Cab2：編碼捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白的基因;Cab1：編碼捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白的基因。**表示野生型與突變體al14之間差異極顯著（P<0.01）;*表示野生型與突變體al14之間差異顯著（P<0.05）。

2.6突變性狀的遺傳分析

為了確定突變性狀的遺傳特征，我們配制了徐稻3號和突變體al14的正反交組合。F1植株葉色正常，自交獲得的F2群體出現(xiàn)分離，正常的綠色植株與白化轉(zhuǎn)綠植株數(shù)比值符合3∶1的分離比（表2）。這表明突變體al14的白化轉(zhuǎn)綠表型由1對隱性核基因控制。

2.7突變性狀的基因定位

將突變體al14與9311雜交，自交一代后種植F2群體，分離出的1 845個(gè)白化轉(zhuǎn)綠單株作為定位群體。通過連鎖分析和增加極端個(gè)體驗(yàn)證，基因初步定位在第1號染色體上在分子標(biāo)記I1-4與I1-5之間 （圖6A）。開發(fā)新引物（表3）進(jìn)一步精細(xì)定位，基因最終被定位在標(biāo)記al14-3和al14-10之間，兩者距離為100.5 kb （圖6B、圖6C）。利用RAP-DB數(shù)據(jù)庫預(yù)測區(qū)間內(nèi)的基因，此區(qū)間內(nèi)含有9個(gè)候選基因（表4）。

2.8候選基因測序

設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增標(biāo)記al14-3和al14-10區(qū)間內(nèi)所有基因的基因組序列，發(fā)現(xiàn)突變體編碼線粒體底物ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因Os01g0265200終止密碼子前插入了18 bp的堿基，序列為GTCGACGGATCCAATCTC，編碼纈氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、亮氨酸6個(gè)氨基酸，終止密碼子也由TAA變?yōu)門AG（圖6）。分別將野生型和突變體al14中的al14編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列輸入swissmodel （http：//swissmodel.expasy.org/workspace） 網(wǎng)站預(yù)測蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)模型和保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，AL14蛋白包含1個(gè)線粒體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)子結(jié)構(gòu)域，保守氨基酸位置為第104～362位。該基因是OsPAPST1的1個(gè)新的等位基因，該基因的突變導(dǎo)致了突變體al14的白化轉(zhuǎn)綠表型。

3討論

水稻中編碼線粒體底物ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因Os01g0265200全基因組長3 905 bp，CDS長1 146 bp， 編碼381個(gè)氨基酸，包含有1個(gè)線粒體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)子保守結(jié)構(gòu)域。本試驗(yàn)精細(xì)定位到的al14和前人報(bào)道的OsPAPST1是等位基因，編碼3′-磷酸腺苷5′-磷酰硫酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（PAPST1），但突變體來源和突變位點(diǎn)不同。突變體papst1來源于日本晴（Nipponbare） 的EMS誘變，該基因在第289位堿基出現(xiàn)1個(gè)點(diǎn)突變，G變?yōu)锳，導(dǎo)致氨基酸也由第97位的丙氨酸（Ala）變成蘇氨酸（Thr）[6];突變體al14來源于徐稻3號的自然突變，終止密碼子前插入了18個(gè)堿基，終止密碼子也由TAA變?yōu)門AG。OsPAPST1和al14的突變都改變了氨基酸序列，2個(gè)突變體均表現(xiàn)出早期白化轉(zhuǎn)綠，株高顯著降低的表型。突變體papst1整個(gè)生育期植株均比野生型矮，突變體al14表現(xiàn)為抽穗后植株生長緩慢，生育期延遲，但有效穗數(shù)，穗長、每穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量、結(jié)實(shí)率與野生型無顯著差異。

植物的光合作用離不開葉綠體[26-28]，突變體al14白化葉中的葉綠體發(fā)育存在缺陷，類囊體膜片層結(jié)構(gòu)變少，出現(xiàn)不連續(xù)的空泡狀結(jié)構(gòu)，雙層膜結(jié)構(gòu)發(fā)育不全，轉(zhuǎn)綠前色素含量顯著低于野生型。以往研究的白化突變體大多也呈現(xiàn)葉綠體發(fā)育缺陷表型[15，17-19，22]，但是程度不同，突變體wltt中大部分葉肉細(xì)胞中觀察不到葉綠體，突變體al14白化葉片中的葉綠體結(jié)構(gòu)異常，而突變體alr中葉綠體數(shù)量變少，即使葉片轉(zhuǎn)綠依然有少量很小、不完全發(fā)育的葉綠體[15]，突變體al14葉片轉(zhuǎn)綠后葉綠體結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。

RT-PCR結(jié)果顯示，突變體al14中葉綠體發(fā)育和光系統(tǒng)相關(guān)基因psaA、psaB、psbA、rpoA、Cab1和Cab2的表達(dá)量都顯著下調(diào)。rpoA、rpoB是葉綠體內(nèi)編碼RNA聚合酶核心亞基的基因，RNA聚合酶參與mRNA轉(zhuǎn)錄，rpo+突變體植株色素含量降低，類囊體發(fā)育缺陷，植株白化[29]，推測由于OsPAPST1/al14基因的突變導(dǎo)致rpoA、rpoB等編碼光合系統(tǒng)、葉綠體發(fā)育部分的基因表達(dá)量下調(diào)，引起葉綠體發(fā)育缺陷。已有研究結(jié)果表明，葉綠體發(fā)育受核質(zhì)基因組協(xié)同調(diào)控，當(dāng)質(zhì)體發(fā)育和代謝狀態(tài)發(fā)生改變的時(shí)候，質(zhì)體基因組反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞核基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[30-31]。wsl2是1個(gè)苗早期葉片呈現(xiàn)白條紋，五葉期后轉(zhuǎn)綠的突變體，與突變體al14相似，葉綠體發(fā)育異常，一些與葉綠素合成、葉綠體發(fā)育和光合系統(tǒng)有關(guān)的基因在mRNA水平上顯著下降。突變體wsl2中質(zhì)核逆行信號受阻，突變基因編碼MCF家族的ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsBT1-3在調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育中起重要作用[30]。黃綠葉突變體ygl8中，葉綠體形態(tài)異常，發(fā)育遲緩，基質(zhì)中出現(xiàn)嗜鋨體，YGL8編碼MgPME環(huán)化酶的催化亞基，該基因突變后，部分參與葉綠素合成基因的表達(dá)量發(fā)生改變，也被認(rèn)為是影響了葉綠體中質(zhì)-核的逆行信號[31]，從而引起葉色突變的原因。PAPST1同時(shí)定位于線粒體外膜和葉綠體外膜，研究認(rèn)為PAPST1更多的充當(dāng)了PAPS轉(zhuǎn)運(yùn)子的功能，在質(zhì)核之間起到逆行信號的作用[6]。本研究中也發(fā)現(xiàn)編碼Mg2+螯合酶H亞基的基因CHLH表達(dá)量顯著上調(diào)，該基因與ChlD和OsChlI在水稻中分別編碼Mg2+螯合酶的H、D和I亞基[32-33]，共同催化Mg-原卟啉IX的形成，而原卟啉IX作為血紅素生物合成的中間產(chǎn)物影響著四吡咯的生物合成。當(dāng)四吡咯代謝平衡被打破后，葉綠素合成速率也會發(fā)生改變，引起葉色變化[34]。推測OsPAPST1/al14突變后，白化苗中葉綠素合成代謝紊亂導(dǎo)致部分前體物質(zhì)含量發(fā)生改變，產(chǎn)生質(zhì)-核的逆行信號，改變相關(guān)核基因的表達(dá)，使葉綠體盡可能地適應(yīng)葉綠素代謝的缺陷[35]。但是al14突變位點(diǎn)不在其保守結(jié)構(gòu)域，編碼多肽的C端增加了6個(gè)氨基酸，這幾個(gè)氨基酸是否改變了PAPST1的構(gòu)象，怎樣影響了其作為3′-磷酸腺苷5′-磷酰硫酸（PAPS）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，同時(shí)是否也承擔(dān)了ADP/ATP的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中如何起作用，還需要通過挖掘互作蛋白，進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證。另外，突變體al14是一個(gè)穩(wěn)定且易于鑒別的常規(guī)粳稻葉色突變體，怎樣將該葉色標(biāo)記導(dǎo)入到不育系中，根據(jù)葉色差異不育系自交種，鑒定雜種的純度，節(jié)省勞力，提高產(chǎn)量，也需要進(jìn)一步實(shí)踐。

參考文獻(xiàn)：

[1]MORITA R， SATO Y， MASUDA Y， et al. Defect innon-yellow coloring 3， an a/b hydrolase-fold family protein， causes a stay-green phenotype during leaf senescence in rice.[J] Plant Journal， 2009， 59： 940-952.

[2]何冰，劉玲瓏，張文偉，等. 植物葉色突變體[J]. 植物生理學(xué)通訊. 2006，42（1）：1-9.

[3]王中豪，賀彥，張曉波，等. 水稻白化轉(zhuǎn)綠和穗頂端退化突變體vpa1的遺傳分析和基因定位[J]. 中國水稻科學(xué)， 2021， 35（1）： 19-26.

[4]TAKEUCHI R， KIMURA S， SAOTOME A， et al. Biochemical properties of a plastidial DNA polymerase of rice[J]. Plant Molecular Biology，2007， 64（5）： 601-611.

[5]DOGRA V， DUAN J， LEE K P， et al. Impaired PSII proteostasis triggers a UPR-like response in the var2 mutant of Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany，2019， 70（12）： 3075-3088.

[6]XU J， YANG J， WU Z， et al. Identification of a dual-targeted protein belonging to the mitochondrial carrier family that is required for early leaf development in rice[J]. Plant Physiology，2013， 161（4）： 2036-2048.

[7]MOCHIZUKI N， BRUSSLAN J A， LARKIN R， et al. Arabidopsis genomes uncoupled 5 （GUN5） mutant reveals the involvement of Mg-chelatase H subunit in plastid-to-nucleus signal transduction[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2001， 98（4）： 2053-2058.

[8]SU N， HU M L， WU D X， et al. Disruption of a rice pentatricopeptide repeat protein causes a seedling-specific albino phenotype and its utilization to enhance seed purity in hybrid rice production[J]. Plant Physiology， 2012， 159（1）： 227-238.

[9]LV Q， XU J， WU P. Ospapst1， a useful mutant for identifying seed purity and authenticity in hybrid rice[J]. Plant Signaling & Behavior，2013， 8（7）： e24819.

[10]THANGAPANDIAN R， BOOPATHI N M， YUVARAJA A. Transient albino and revertible to green （TARGreen） rice mutant： simple， affordable and beneficial novel tag for rapid genetic purity testing in rice （Oryza sativa L.）[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2020， 67：1949-1955.

[11]KUSUMI K， SAKATA C， NAKAMURA T， et al. Plastid protein NUS1 is essential for build the genetic system for early chloroplast development under cold stress conditions[J]. Plant Journal for Cell and Molecular Biology， 2011，68（6）：1039-1050.

[12]SUGIMOTO H， KUSUMI K， TOZAWA Y， et al. The virescent-2 mutation inhibits translation of plastid transcripts for the plastid genetic system at an early stage of chloroplast differentiation[J]. Plant and Cell Physiology，2004， 45（8）： 985-996.

[13]YOO S C， CHO S H， SUGIMOTO H， et al. Rice Virescent3 and Stripe1 encoding the large and small subunits of ribonucleotide reductase are required for chloroplast biogenesis during early leaf development[J]. Plant Physiology， 2009， 150（1）： 388-401.

[14]SUN J， ZHENG T， YU J， et al. TSV， a putative plastidic oxidoreductase， protects rice chloroplasts from cold stress during development by interacting with plastidic thioredoxin Z[J]. The New Phytologist， 2017，251（1）：240-255.

[15]NIU M， WANG Y， WANG C， et al. ALR encoding dCMP deaminase is critical for DNA damage repair， cell cycle progression and plant development in rice[J]. Journal of Experimental Botany，2017， 68（21/22）： 5773-5786.

[16]XU J， WANG L， ZHOU M Y， et al. Narrow albino leaf 1 is allelic to CHR729， regulates leaf morphogenesis and development by affecting auxin metabolism in rice[J]. Plant Growth Regulation， 2017， 82（1）： 175-186.

[17]LIN D， JIANG Q， ZHENG K， et al.Mutation of the rice ASL2 gene encoding plastid ribosomal protein L21 causes chloroplast developmental defects and seedling death[J]. Plant Biology， 2015， 17（3）： 599-607.

[18]WANG W Y， DENG C， AI P F， et al. ALM1， encoding a Fe-superoxide dismutase， is critical for rice chloroplast biogenesis and drought stress response[J]. The Crop Journal， 2020，9（5）：1018-1029.

[19]LIU X， CAO P H， HUANG Q Q， et al. Disruption of a rice Chloroplast-Targeted gene OsHMBPP causes a seedling-lethal albino phenotype[J]. Rice，2020， 13（1）：51-62.

[20] ZENG X Y， TANG R， GUO H R，et al. A naturally occurring conditional albino mutant in rice caused by defects in the plastid-localized OsABCI8 transporter[J]. Plant Molecular Biology， 2017， 94（1/2）： 137-148.

[21]HE Y， SHI Y F， ZHANG X B， et al. The OsABCI7 transporter interacts with OsHCF222 to stabilize the thylakoid membrane in rice[J]. Plant Physiology， 2020， 184（1）： 283-299.

[22]林添資，孫立亭，龔紅兵，等.一個(gè)水稻低溫移栽白條紋突變體wltt的鑒定和基因定位[J].中國水稻科學(xué)， 2019， 33（1）： 1-11.

[23]WU Z M， ZHANG X， HE B， et al. A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2007， 145（1）： 29-40.

[24]LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）） Method[J]. Methods，2001， 25（4）： 402-408.

[25]SHI Y， CHEN J， LIU W， et al. Genetic analysis and gene mapping of a new rolled-leaf mutant in rice （Oryza sativa L.） [J]. Science China Life Sciences， 2009， 52（9）： 885-890.

[26]李君，婁運(yùn)生，馬莉，等. 夜間增溫和水分管理耦合對水稻葉片光合作用和熒光特性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2019，35（3）：506-513.

[27]郝正剛，王志恒，魏玉清，等. 外源鈣鎘處理對甜高粱幼苗葉片光合作用的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（19）：75-80.

[28]王銳潔，劉筱，楊淑君，等.氮沉降背景下遮陰對虎耳草生長和光合作用的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，50（2）：330-337.

[29]SANTIS-MACIOSSEK G D， KOFER W， BOCK A， et al. Targeted disruption of the plastid RNA polymerase genes rpoA， B and C1： Molecular biology biochemistry and ultrastructure[J]. Plant Journal， 1999， 18：477-489.

[30]LYU J， WANG Y， LIU L， et al. A putative plastidial adenine nucleotide transporter， BRITTLE1-3， plays an essential role in regulating chloroplast development in rice （Oryza sativa L.） [J]. Journal of Plant Biology，2017， 60（5）： 493-505.

[31]KONG W， YU X， CHEN H， et al. The catalytic subunit of magnesium-protoporphyrin IX monomethyl ester cyclase forms a chloroplast complex to regulate chlorophyll biosynthesis in rice[J]. Plant Molecular Biology，2016， 92（1/2）： 177-191.

[32]JUNG K H， HUR J， RYU C H， et al. Characterization of a rice chlorophyll-deficient mutant using the T-DNA gene-trap system[J]. Plant & Cell Physiology， 2003， 44： 463-472.

[33]ZHANG H， LI J， YOO J H， et al. Rice Chlorina-1 and Chlorina-9 encode ChlD and ChlI subunits of Mg-chelatase， a key enzyme for chlorophyll synthesis and chloroplast development[J]. Plant Molecular Biology，2006， 62： 325-337.

[34]TADINI L. Molecular and physiological dissection of GUN1 chloroplast-to-nucleus retrograde signaling[M]. Berlin，Germany：Springer，2013.

[35]TERRYM J， SMITH A G. A model for tetrapyrrole synthesis as the primary mechanism for plastid-to-nucleus signaling during chloroplast biogenesis[J]. Frontiers in Plant Science，2013， 4： 14.

（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-03-24

基金項(xiàng)目：江蘇省重點(diǎn)研發(fā)（現(xiàn)代農(nóng)業(yè)）項(xiàng)目（BE2021359）;國家水稻產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-01-59）;徐州市重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（KC20041、KC18238）;徐州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研基金項(xiàng)目（XM2019002）

作者簡介：胡婷婷（1980-），女，土家族，湖北宜昌人，博士，副研究員，主要從事水稻遺傳育種。（E-mail）htt713@163.com