帕金森病食蟹猴系統(tǒng)性模型構(gòu)建與在體臨床過程的動態(tài)評價研究*

馬任馳 羅斌斌 岳 峰,3

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，長壽與老年相關(guān)疾病教育部重點實驗室，南寧 530021)(2.廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司，南寧 530000)(3．首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京市帕金森病重點實驗室，北京 100053)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，其主要病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量變性、缺失和胞質(zhì)內(nèi)包涵體-路易小體(Lewy body，LB)生成[1]，且紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的損失與PD運動癥狀緊密相關(guān)[2]。PD臨床表現(xiàn)為肌震顫、肌僵直、姿勢不穩(wěn)、運動遲緩等運動癥狀[3]。PET利用分子活體成像技術(shù)在PD的早期診斷和病情監(jiān)測發(fā)揮了重要作用[4]。由于該病的病理生理機制至今仍未完全明確[5]，PD的診斷、治療仍是現(xiàn)代臨床研究中面臨的一個棘手的問題。

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine, MPTP) 對大腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元有選擇性的破壞作用，是目前國內(nèi)外公認(rèn)的誘導(dǎo)動物PD模型的首選造模制劑[6-7]。而系統(tǒng)性MPTP全身給藥是最常見、有效的方式[8]，其產(chǎn)生可靠的黑質(zhì)紋狀體多巴胺能通路病變，并誘導(dǎo)與人類PD臨床特征與藥效反應(yīng)極為相似的改變。有研究表明[9]，左旋多巴(L-dopa)是一種用于恢復(fù)紋狀體生理條件多巴胺(DA)濃度的替代藥物，其在適宜濃度范圍內(nèi)可有效緩解PD的癥狀。

本研究采用連續(xù)靜脈注射MPTP方式誘導(dǎo)構(gòu)建食蟹猴PD系統(tǒng)性模型，應(yīng)用臨床評分、PET掃描顯像、隨意運動量的監(jiān)測觀察PD癥狀的變化，同時給予L-Dopa干預(yù)后是否顯著改善PD癥狀與運動功能等方法評估模型，在體動態(tài)模擬了PD的臨床過程與特征，為未來PD研究與臨床治療提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

健康食蟹猴7只(12.45±2.45)歲；雄性5只，雌性2只，體質(zhì)量(7.10±1.11)kg，由廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司實驗室提供[以下簡稱靈康公司，SYXK(桂)2014-0004]，該實驗室經(jīng)過國際實驗動物評估和認(rèn)可委員會(AAALAC)認(rèn)證。本研究所有實驗均在靈康公司實驗室完成。實驗期間動物飼養(yǎng)環(huán)境和福利得到充分保證：所有動物均在標(biāo)準(zhǔn)單籠飼養(yǎng)，動物房溫度16～26 ℃，相對濕度為40%～ 70%，動物籠內(nèi)照度為100～ 200 lx，12 h明/12 h暗循環(huán)交替(7:00開燈/19:00關(guān)燈)，每日早晚兩次(8:00/16:00)喂食標(biāo)準(zhǔn)實驗動物猴配合飼料(GB14924.8)，并供給不限量安全飲用水，中午提供適量新鮮蔬菜或水果。該研究方案已由動物倫理委員會(IACUC)審核并獲得批準(zhǔn)。

1.2 材料

MPTP(美國Sigma 公司)、西門子 Biograph Sensation 16HR PET掃描儀，顯像劑18F-AV-133(廣西醫(yī)科大學(xué)一附院PET中心提供)、多巴絲肼片(上海羅氏公司)、EthoVision XT視頻跟蹤系統(tǒng)(荷蘭Noldus公司)、便攜式錄像機(日本Sony公司)

1.3 方法

1.3.1MPTP誘導(dǎo)食蟹猴系統(tǒng)性PD模型的建立：7只食蟹猴注射阿托品(0.05 mg/kg)20 min后行氯胺酮(0.2 mL/kg)肌注麻醉，將MPTP-HCl(0.1 mg/mL)每天(上午9:00)以0.2 mg / kg緩慢注入下肢靜脈，連續(xù)注射14 d，平均總體用量(18.70±2.83)mg。

1.3.2L-Dopa干預(yù)：MPTP注射后3個月行L-Dopa(100 mg/次)灌胃干預(yù)[多巴絲肼片：規(guī)格250 mg(左旋多巴200 mg+芐絲肼50 mg)/片；濃度為1 mg/mL]，2次/d(9:00/16:00)，持續(xù)14 d。

1.4 模型評估

1.4.1PD臨床評分：將動物移至標(biāo)準(zhǔn)靈長類行為籠中適應(yīng)環(huán)境至少20 min，在基線與MPTP開始造模后1、2、3 月及L-Dopa干預(yù)14 d后進(jìn)行行為學(xué)錄像1 h，觀察動物在行為籠中的行為變化。結(jié)合非人靈長類動物帕金森病模型臨床評分量表Kurlan(1991)[10]，對動物籠內(nèi)表現(xiàn)出的臨床癥狀進(jìn)行雙盲評分。評分內(nèi)容含10項：即靜止性震顫(0～3分)、動作性或意向性震顫(0～3分)、面部表情(0～3分)、步態(tài)(0～3分)、運動徐緩(全身)(0～4分)、姿勢(0～2分)、平衡與協(xié)調(diào)(0～3分)、下肢總體運動技能(0～3分)、上肢總體運動技能(0～3分)、防御反應(yīng)(0～2分)。總分最小0分為正常行為，最高29分為最嚴(yán)重。

1.4.2健康狀況評估：將體質(zhì)量作為評價健康狀況的生理指標(biāo)[8]，在整個造模期間于每周四下午對動物無麻醉狀態(tài)下測量一次體質(zhì)量。

1.4.3隨意運動量分析：動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)EthoVision XT[11-12]可自動跟蹤、監(jiān)測和量化錄像中動物的隨意運動距離，以及精細(xì)描繪動物在籠內(nèi)運動的路徑軌跡。所有動物1 h行為學(xué)錄像均采用相同的測試參數(shù)，每次測試均執(zhí)行一次。在測試運動行為之前需要描繪出動物檢測區(qū)域，然后規(guī)定動物在此區(qū)域內(nèi)作為跟蹤中心點，同時通過控制指定程序“開始”和“停止”時間來自動采集隨意運動量數(shù)據(jù)。

1.4.4PET顯像與圖像分析：隨機選取其中5只動物，以氯胺酮(7～10)mg/kg肌注麻醉，分別在基線與MPTP開始造模后3 個月行大腦PET 掃描，采用Liu等[13]報道的方法及條件顯像。利用放射性配體AV-133與2型單胺囊泡轉(zhuǎn)運體(VMAT2)結(jié)合位點的高選擇性，通過18F標(biāo)記后，觀察食蟹猴18F-AV-133紋狀體的放射性顯像情況。掃描操作及圖像后處理由PET中心專職技術(shù)人員完成。通過計算紋狀體特異性攝取率(Sur)評估食蟹猴造模后紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的受損程度，定義Sur=[(平均紋狀體攝取量 - 平均小腦攝取量)/ 平均小腦攝取量]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MPTP誘導(dǎo)PD食蟹猴系統(tǒng)性模型

2.1.1臨床評分：所有動物在MPTP開始造模后進(jìn)行3個月行為學(xué)觀察，根據(jù)PD評分量表對動物表現(xiàn)出的臨床癥狀進(jìn)行評分。所有動物基線臨床評分均為0分。在注射結(jié)束時所有動物均出現(xiàn)PD癥狀，臨床評分均達(dá)到10分及以上。在1個月時臨床評分達(dá)到峰值，均出現(xiàn)典型的PD癥狀，即軀體嚴(yán)重屈曲、兩側(cè)肢體震顫、運動遲緩、步態(tài)搖晃以及面具臉、豎尾等，嚴(yán)重影響動物的行為活動，同時出現(xiàn)攝食困難和活動不便，甚至出現(xiàn)便秘、夜尿多的自主代謝異常等癥狀。之后連續(xù)觀察2個月仍然存在PD運動癥狀。在2個月(18.43±3.87)、3個月(18.14±3.53)臨床癥狀趨于穩(wěn)定(見圖1)，與注射結(jié)束時(14.43±1.90)相比，臨床評分均顯著增高(P<0.05)；與1個月時(21.43±5.35)相比，臨床評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 基線、MPTP注射14 d結(jié)束時、1、2、3個月以及L-Dopa干預(yù)后臨床評分的比較注： *P<0.05Fig.1 The comparison of baseline, after MPTP injectionat the end of 14 days, 1, 2, 3 months, and after L-Dopaintervention about clinical scoresNote: *P<0.05

2.1.2健康狀況：通過MPTP開始注射前后以及模型期動物的體質(zhì)量觀察和監(jiān)測，在造模過程中體質(zhì)量基本趨于穩(wěn)定，體質(zhì)量變化不明顯。全程模型期的體質(zhì)量變化情況見圖2。

圖2 體質(zhì)量的變化Fig.2 Changes in weight

2.1.3隨意運動量：隨著MPTP造模后時間延長，隨意運動距離較基線明顯減少，即3個月運動距離(809.77±401.15)cm較基線(8627.46±5751.04)cm顯著下降(P<0.01)(見圖3A)。3個月時1 h內(nèi)每隔30 s的隨意運動距離較基線明顯減少(見圖3B)，動物籠內(nèi)運動軌跡見圖5。

2.1.4PET顯像：基線與3個月18F-AV-133 PET顯像情況見圖4 A。PET顯像結(jié)果顯示，3個月雙側(cè)紋狀體平均Sur(0.16±0.03)較基線(1.66±0.58)顯著下降(P<0.01)(見圖4B)。

2.2 L-Dopa干預(yù)后運動行為的變化

2.2.1臨床評分：所有動物經(jīng)過L-Dopa干預(yù)后PD癥狀顯著改善。L-Dopa干預(yù)后(12.86±3.63)與開始造模后1個月、3個月相比，臨床評分均顯著降低(P<0.05)(見圖1)。

2.2.2隨意運動量：L-Dopa干預(yù)后動物活動增多，運動距離(2645.77±1753.90)cm較開始造模后3個月顯著增加(P<0.05)(見圖3A)。L-Dopa干預(yù)后1 h 內(nèi)每隔30 s的運動距離較開始造模后3個月明顯增加(見圖3B)，動物籠內(nèi)運動軌跡見圖5。

圖3 運動距離的變化注：A：與基線比較，**P<0.01；與MPTP開始造模后3個月比較，*P<0.05；B：基線、MPTP開始造模后3個月以及L-Dopa干預(yù)后1 h內(nèi)每隔30 s的隨意運動距離情況Fig.3 Changes in the moved distanceNote: A: compared with baseline, **P<0.01; compared with 3 months after MPTP injection, *P<0.05; B: The random moved distance every 30 s within 1 h on baseline, 3 months after the first MPTP injection and after L-Dopa intervention

圖4 基線與3個月紋狀體18F-AV-133攝取的PET顯像注：A：a: 雙側(cè)紋狀體呈現(xiàn)清晰且均勻?qū)ΨQ的放射性顯像分布；b: 放射性分布對稱性減弱；B：與基線比較，**P<0.01Fig.4 PET imaging of striatum 18F-AV-133 uptake ratio on baseline and 3 monthsNote: A: a: bilateral striatum presents a clear and uniform symmetrical radiographic distribution; b: radioactive distribution symmetry is weakened; B: compared with baseline, **P<0.01

圖5 基線、開始造模后3個月以及L-Dopa干預(yù)后運動軌跡可視圖注：紅線表示動物運動軌跡路徑。Fig.5 Track visualization images on baseline, 3 months after the start of modeling and after L-Dopa interventionNote: The red line indicates the path of the animal’s motion track

3 討論

在PD基礎(chǔ)和臨床研究中，建立穩(wěn)定的動物模型對研究其病因、發(fā)病機制及療效評價至關(guān)重要。靈長類動物在進(jìn)化和結(jié)構(gòu)功能方面與人類非常接近，因此該模型在研究人類腦神經(jīng)相關(guān)疾病中具有獨特的模型優(yōu)勢[14-16]。應(yīng)用MPTP誘導(dǎo)靈長類PD動物模型已被廣泛報道[17-18]，Emborg等[19]經(jīng)頸內(nèi)動脈注射MPTP成功造模，但該方法手術(shù)技術(shù)要求較高。本研究采用靜脈注射MPTP方法構(gòu)建系統(tǒng)性PD猴模型，操作簡便、經(jīng)濟高效，且更接近PD的臨床表現(xiàn)。由于PD藥物、干細(xì)胞、基因治療評價等臨床前轉(zhuǎn)化研究需要在活體狀態(tài)對模型動物進(jìn)行動態(tài)綜合評價，這對靈長類PD模型在臨床癥狀、多巴胺能神經(jīng)功能的半定量評估、治療后反應(yīng)等保持全程的穩(wěn)定性提出更高的要求。本研究從食蟹猴建模到模型穩(wěn)定以及給予L-Dopa干預(yù)，模擬了整個PD臨床過程的動態(tài)變化特征。

本研究中食蟹猴靜脈注射MPTP 14 d后出現(xiàn)了典型的PD癥狀，Bezard 等[20]通過表征黑質(zhì)紋狀體變性的動力學(xué)，進(jìn)而確定了PD癥狀產(chǎn)生是其變性達(dá)閾值的結(jié)果。而MPTP進(jìn)入血液循環(huán)后，其毒性代謝物MPP+對胃腸系統(tǒng)產(chǎn)生急性毒副作用，故本研究所有動物在開始給藥后即進(jìn)行營養(yǎng)支持與健康監(jiān)測是降低因體質(zhì)量快速下降而造成死亡風(fēng)險的關(guān)鍵。在停止MPTP注射時所有動物臨床評分達(dá)到10分及以上，以保證每只動物均出現(xiàn)典型PD癥狀進(jìn)而最大限度減少個體差異。典型的PD癥狀連續(xù)維持3個月且未死亡，同時伴有不同程度的非運動癥狀，其可能與藍(lán)斑、相關(guān)腦干以及中縫背核等部位病變有關(guān)[21]。此外，PET分子影像學(xué)數(shù)據(jù)表明，在開始造模前與造模后3個月注射顯像劑18F-AV-133后掃描成像，基線雙側(cè)紋狀體呈現(xiàn)清晰且均勻?qū)ΨQ的放射性顯像分布，而造模后3個月放射性分布對稱性明顯減弱，同時平均 Sur較造模前顯著降低(約90%)，證明了紋狀體多巴胺能神經(jīng)功能的損失，診斷價值極高。但此方法檢查費用昂貴，技術(shù)要求高，且顯像劑合成操作復(fù)雜等限制了其廣泛應(yīng)用。Chen等[22]認(rèn)為紋狀體中突觸前多巴胺標(biāo)志物的進(jìn)行性喪失與PD表現(xiàn)有關(guān)，其中VMAT2減少是黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元變性之前的關(guān)鍵致病因子，其可能是氧化應(yīng)激引起的突觸核蛋白聚集的結(jié)果，而本研究造模過程中是否有LB的出現(xiàn)及相關(guān)神經(jīng)元的變性壞死，則需通過神經(jīng)病理進(jìn)一步研究。給予L-Dopa干預(yù)14 d后，動物PD癥狀顯著改善，運動能力逐漸恢復(fù)，活動能力增加，該反應(yīng)主要針對腦基底節(jié)DA含量的不足，與DA神經(jīng)末梢纖維的缺失有關(guān)[23]。同時L-Dopa藥效反應(yīng)也模擬了臨床PD的療效特征。

本課題采用EthoVision運動軌跡跟蹤系統(tǒng)的運動活動量評價方法，自動分析動物1 h籠內(nèi)隨意運動距離與運動軌跡。在造模后3個月隨意運動距離明顯減少，經(jīng)L-Dopa干預(yù)后反而增加，與已報道的結(jié)果趨勢一致[24]。目前，該方法已有報道用于斑馬魚、鼠類、靈長類動物等運動行為的研究[11, 25-26]。Walton等[27]利用此方法分析了恒河猴在不同年齡段的運動距離與軌跡等，但鮮有報道食蟹猴PD模型的運動行為活動評估。相比其他檢測方法[28]，此方法更能精確地呈現(xiàn)動物的空間運動軌跡，實現(xiàn)了動物籠內(nèi)運動行為活動的客觀量化、可視化與形象化。

綜上所述，連續(xù)靜脈注射MPTP構(gòu)建的PD系統(tǒng)性模型臨床癥狀持續(xù)存在，多巴胺神經(jīng)功能損害，且對L-Dopa干預(yù)有效，無自發(fā)性恢復(fù)，在體動態(tài)模擬了PD的臨床過程，為PD臨床轉(zhuǎn)化研究提供了模型依據(jù)。