不同組成酸化劑對羅非魚生長性能和抗氧化及肝臟代謝酶活性的影響

■林 雪 段靜娜 趙玉蓉 王紅權(quán)*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.廣州天科生物科技有限公司，廣東廣州 510896）

集約化養(yǎng)殖系統(tǒng)中的魚類面對各種各樣環(huán)境應(yīng)激，如高密度養(yǎng)殖條件下的密度脅迫，會引起氧化應(yīng)激[1-2]；魚類對水溫變化有較強(qiáng)的敏感性，溫度應(yīng)激會導(dǎo)致魚體產(chǎn)生代謝應(yīng)激反應(yīng)[3]；另外，復(fù)雜的水環(huán)境，如水生態(tài)環(huán)境惡化，人工捕撈，水體交換差，水中低氧脅迫[4]，金屬離子過多[5]等等，都會造成一系列的氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]；氧化應(yīng)激是動物機(jī)體自由基生成增加或清除能力降低，導(dǎo)致動物機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)功能紊亂，最終引起氧化損傷，代謝酶活性降低，生長受阻[7]。復(fù)合酸化劑避免單一酸化劑功能的單一、腐蝕性強(qiáng)、添加量大等缺點，現(xiàn)多取代單一酸化劑應(yīng)用于養(yǎng)殖行業(yè)中，可提高動物抗應(yīng)激能力[8-9]。復(fù)合型酸化劑主要是由多種有機(jī)酸復(fù)配而成，各種酸之間起協(xié)同增效的作用，可提高飼料的適口性及飼料轉(zhuǎn)化率，也可作為防霉劑和抗氧化劑保持飼料品質(zhì)，同時還可作為代謝調(diào)節(jié)劑直接被機(jī)體吸收，參與體內(nèi)的物質(zhì)代謝[10]。有研究表明添加酸化劑對水產(chǎn)動物有一定促進(jìn)生長性能的作用[11-12]。本試驗以羅非魚幼魚為研究對象，研究市場上不同配方組成復(fù)合型水產(chǎn)酸化劑對魚類的生長性能、血清和肝臟抗氧化、酶活性效果的影響，為復(fù)合型酸化劑在水產(chǎn)飼料上的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗魚的羅非魚由廣州番禺魚種場提供。

酸化劑1（主要成分為甲酸、乙酸和丁二酸），酸化劑2（主要成分為檸檬酸和富馬酸），酸化劑3（主要成分為富馬酸和丙酸）。

試驗的羅非魚基礎(chǔ)飼糧配方及營養(yǎng)水平見表1。以基礎(chǔ)日糧(pH值5.36，系酸力52.98 mmol/100 g)為對照組，分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.2%酸化劑，配制試驗1 組日糧（pH 值5.31，系酸力50.97 mmol/100 g）、試驗2 組日糧（pH 值5.23，系酸力52.81 mmol/100 g）和試驗3組日糧（pH值5.28，系酸力51.83 mmol/100 g）。所有飼料原料先按配方表1稱料，先混小料，大原料粉碎后40目過篩，將所有原料在攪拌機(jī)中混勻后，邊攪拌邊慢慢加油，最后用雙螺旋擠壓成粒徑約為1.5 mm的條狀飼料，自然風(fēng)干后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(%)

1.2 試驗設(shè)計

試驗用羅非魚魚種運回實驗室后在室內(nèi)循環(huán)過濾水族桶中馴養(yǎng)（容積為500 L）兩周，待其適應(yīng)環(huán)境后，選取體格相近的健康羅非魚300 尾[初始體重為（67.40±0.93）g]，隨機(jī)分成4個處理組，分別為對照組（飼喂基礎(chǔ)飼糧）、試驗1 組（飼喂添加酸化劑1 的日糧）、試驗2組（飼喂添加酸化劑2的日糧）和試驗3組（飼喂添加酸化劑3的日糧），每個處理設(shè)3個重復(fù)桶，每個重復(fù)桶放養(yǎng)25 尾魚。試驗水經(jīng)生化棉過濾，用低壓鼓風(fēng)機(jī)加氧。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗期間，每天分別在8:00 和16:00 投喂相應(yīng)飼糧，日投食量為魚體重的6%左右，投喂1 h 后吸出殘餌和糞便，然后換水（約1/3 體積）。每天觀察魚的健康狀況，記錄死亡情況，飼養(yǎng)周期共35 d。試驗期間水溫26～30 ℃，pH 值7.0～7.5，NH4+＜0.02 mg/l，亞硝酸鹽＜0.1 mg/l，溶氧＞5 mg/l。

1.4 樣品采集和指標(biāo)測定

養(yǎng)殖試驗于第36 d結(jié)束，禁食24 h后于第37 d取樣，以桶為單位稱重、記數(shù)，計算生長指標(biāo)。然后每桶隨機(jī)取6尾魚，尾靜脈取血，離心后取血清置于-20 ℃冰箱保存；冰盤上打開腹腔，取出肝臟用濾紙輕輕吸去水分，迅速稱重后儲存在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎媚暇┙ǔ缮锕こ萄芯克噭┖邪凑f明書檢測血清和肝臟樣中的抗氧化和代謝酶活性指標(biāo)。其檢測指標(biāo)為：總超氧化物歧化酶(T-SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6PGDH)和異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）。計算增重率、餌料系數(shù)和肝體比指標(biāo)。

增重率(%)=100×(魚末均重-魚初均重)/魚初均重

餌料系數(shù)=魚均餌料攝入量/(魚末均重-魚初均重)

肝體比（%）=100×肝臟重/魚體重

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。單因素方差分析（one-way ANO-VA）比較各組間差異，Duncan's 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同組成酸化劑對羅非魚生長性能和肝體比的影響（見表2）

表2 不同組成酸化劑對羅非魚生長性能的影響

由表2可知，不同組成酸化劑的添加影響羅非魚的末均重、增重率和餌料系數(shù)。試驗1 組（甲酸+乙酸+丁二酸）末均重顯著高于對照組和酸化劑試驗3組（富馬酸+丙酸）（P＜0.05）；而酸化劑試驗2組（檸檬酸+富馬酸）增重率，顯著高于酸化劑試驗3 組（P＜0.05）。

與試驗3 組相比，試驗1 組和試驗2 組餌料系數(shù)顯著降低（P＜0.05），但兩組之間差異不顯著（P＞0.05）

與對照組相比，酸化劑試驗1 組的肝體比降低4.00%，酸化劑試驗2組的肝體比提高11.11%，而酸化劑試驗3 組的肝體比提高了2.22%，但各組間的肝體比差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同組成酸化劑對血清和肝臟生化指標(biāo)的影響(見表3、表4)

表3 不同組成酸化劑對羅非魚血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，與對照組、酸化劑試驗1組和試驗3組相比，酸化劑試驗2組顯著提高血清的總抗氧化能力（T-AOC）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）（P＜0.05）；但是酸化劑的添加并未顯著改變血清總超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA）的含量（P＞0.05）。

表4 不同組成酸化劑對羅非魚肝臟生化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對照組相比，試驗1組和試驗3組顯著降低肝臟T-AOC；但是，不同組成的復(fù)合酸化劑對肝臟T-SOD、MDA、ACP、AKP、異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）和6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6PGDH）并未有顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

在飼料中加入酸化劑，可使其胃腸道pH值下降，保證消化酶在正常pH 值環(huán)境下發(fā)揮酶活性，從而提高飼料中蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素的消化率[8]，并且有一定的誘食和促生長效果[9，13]。而復(fù)配酸化劑總酸含量高，各成分間協(xié)同增效作用強(qiáng)，降低胃腸道pH 值，起到抑菌殺菌作用，并且其中某些有機(jī)酸是機(jī)體代謝的中間產(chǎn)物，可直接參與機(jī)體中的物質(zhì)代謝，可被直接吸收利用。尚衛(wèi)敏等[11]發(fā)現(xiàn)添加乳酸、檸檬酸和復(fù)合酸顯著改善草魚增重率與飼料轉(zhuǎn)化率；潘慶等[14]也發(fā)現(xiàn)在飼料中分別添加0.3%檸檬酸、乳酸也能提高羅非魚幼魚的生長性能，但0.3%富馬酸反而降低羅非魚對飼料的利用。本研究中，不同配伍酸化劑對羅非魚生長性能的影響存在差異，甲酸+乙酸+丁二酸和富馬酸+檸檬酸的復(fù)合酸化劑配伍與對照組相比都促進(jìn)羅非魚的生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率，而富馬酸+丙酸的配伍則并未發(fā)現(xiàn)該效果，一是由于酸降低了飼料的pH 值，二是由于酸的抑菌抗菌作用。而酸類酸化日糧的能力強(qiáng)弱甲酸＞蘋果酸=檸檬酸＞乙酸。并且每種酸都有其獨特的pK 值，定義為酸50%解離時的pH值。pK值越大，酸解離越難。甲酸pK值為3.77，殺菌抑菌效果非常明顯。任何一種酸調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)都需要在一定的pH 值范圍內(nèi)進(jìn)行，由幾種可在不同pH值范圍內(nèi)發(fā)揮作用的有機(jī)酸復(fù)配在一起拓寬了抑菌和調(diào)菌區(qū)系，使得添加量更少，作用效果更顯著，各組分能相互起到協(xié)同增效的作用。因此飼料中添加甲酸+乙酸+丁二酸的復(fù)合酸不僅可以有效的酸化日糧，保證消化酶在正常pH值環(huán)境下發(fā)揮酶活性，促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還可以優(yōu)化羅非魚腸道菌群結(jié)構(gòu)，減弱有害微生物對宿主的影響。試驗2組中添加的檸檬酸是羅非魚體內(nèi)三羧酸循環(huán)中由乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合而成的第一個中間產(chǎn)物，是機(jī)體容易利用的能源，可被直接吸收參與體內(nèi)能量、酸堿平衡等一系列重要代謝過程，從而提高羅非魚對日糧中養(yǎng)分物質(zhì)的消化吸收。

動物機(jī)體的總抗氧化能力T-AOC與機(jī)體的健康程度存在密切關(guān)系，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)包含有酶促與非酶促兩個體系，其中T-SOD 屬于酶促體系[6，15-16]。在本試驗中，各組間血清和肝臟的T-SOD 活性都沒有顯著性差異，但是，酸化劑試驗2 組中的血清TAOC 顯著上升，而T-AOC 作為評價機(jī)體抗氧化性能的總體指標(biāo)，其大小可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力，其提高表明改善了魚的抗氧化系統(tǒng)功能，提高了魚機(jī)體的抗氧化性能[17-18]，這說明作為高效抗氧化劑的檸檬酸在富馬酸的協(xié)同作用下更好地清除魚體內(nèi)過多活性氧自由基分子，有效清除超氧陰離子（O2-·）抑制和切斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[19]。更好地維持機(jī)體抗氧化系統(tǒng)平衡[20]，檸檬酸形成能量的途徑比葡萄糖還短，在應(yīng)激狀態(tài)下可用于ATP 的緊急合成，提高機(jī)體的非特異性抵抗力，增強(qiáng)抗應(yīng)激能力。而富馬酸的添加則具有協(xié)同作用，可以有效增強(qiáng)檸檬酸的抗氧化作用[21]。

ACP與AKP是機(jī)體兩種重要的功能調(diào)節(jié)酶，與機(jī)體的生長密切相關(guān)[22]。其血清ACP 和AKP 活力受攝食狀況、生長階段、環(huán)境等因素影響而發(fā)生變化[3]。ACP 是在酸性條件下催化磷酸單酯的水解酶[23-24]，AKP 廣泛存在于各種動物體內(nèi)，能催化水解磷酸單酯，直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，是動物體內(nèi)重要的解毒體系[11]；AKP 也是一種腸上皮刷狀緣膜酶，與魚類的消化間接相關(guān)[25-26]，一般認(rèn)為，魚體內(nèi)AKP 參與了魚腸上皮細(xì)胞的吸收與轉(zhuǎn)運，協(xié)助腸上皮細(xì)胞吸收葡萄糖、脂類、鈣和無機(jī)磷[27]。本試驗結(jié)果顯示，不同配伍的酸化劑對羅非魚血清ACP 和AKP 的影響差異顯著，檸檬酸+富馬酸組的血清ACP 和AKP 與富馬酸+丙酸組相比顯著提高，這與之前試驗結(jié)果一致。有研究表明，水生動物中添加檸檬酸可以有效的提高干物質(zhì)消化率，促進(jìn)消化酶發(fā)育。在奧尼羅非魚飼料中添加10 g/kg檸檬酸使胃蛋白酶活性提高29.6%，肝胰臟和腸道淀粉酶活性分別提高30.7%和29.4%（P＜0.01）。而檸檬酸可以改善酶活性可能與其降低胃腸道pH 值并作為中間物質(zhì)直接參與能量代謝有關(guān)，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

單一酸化劑具有功能單一、添加量大、刺激性強(qiáng)等缺點，而復(fù)合酸化劑可以有效克服上述缺點。進(jìn)行復(fù)合酸化劑配伍時，除應(yīng)根據(jù)日糧系酸力來確定滿足維持機(jī)體消化道酸度所需的酸化劑添加量、實現(xiàn)日糧酸化與電解質(zhì)平衡[28-29]，還應(yīng)根據(jù)不同酸的解離度以及作用機(jī)理進(jìn)行合理配比，從而充分發(fā)揮酸化劑生理功能[30]。本試驗結(jié)論表明，甲酸+乙酸+丁二酸以及檸檬酸+富馬酸的復(fù)合酸化劑配伍實現(xiàn)了不同酸化劑之間的協(xié)同合作，有效改善羅非魚生長性能，提高機(jī)體抗氧化能力。