珊瑚共附生黃柄曲霉次級代謝產(chǎn)物研究

王洪亮，姜文麗，李 冉，許聰聰，張 文

(1.海軍軍醫(yī)大學藥學院 上海 200433; 2.陸軍軍醫(yī)大學士官學校，河北 石家莊 050000；3.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230000)

真菌是珊瑚共附生微生物的主要組成部分，目前已報道的珊瑚共附生真菌涵蓋44個屬[1]。在海洋高鹽、高壓、低溫、寡營養(yǎng)的生存環(huán)境下，以及真菌與宿主珊瑚之間的相互作用下，形成了獨特的代謝機制，產(chǎn)生了許多結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的次級代謝產(chǎn)物[2]。

曲霉屬(Aspergillussp.)真菌是海洋真菌中優(yōu)勢菌種之一，分布非常廣泛[3]。黃柄曲霉(Aspergillusflavipes)屬于傘囊菌目發(fā)菌科曲霉屬，在海洋和陸地均有分布。其次級代謝產(chǎn)物的主要類型包括細胞松弛素類[4-6]、epicoccine衍生物[7-8]、丁內(nèi)酯類[9]等。本次研究的黃柄曲霉是采自東沙的短足軟珊瑚(Cladiellasp.)中分離得到的，通過運用多種色譜分離技術(shù)，得到4個細胞松弛素類化合物(圖 1)。對這4個化合物進行體外抑制破骨細胞分化活性測試中，發(fā)現(xiàn)化合物3和4對BMMs向成熟破骨細胞分化有不同程度的抑制活性。本文是對化合物3和4抑制破骨細胞分化活性的首次報道。

圖1 4個細胞松弛素類化合物的結(jié)構(gòu)式

1 材料和方法

1.1 樣品

從采自東沙的短足軟珊瑚(Aspergillusflavipes)，菌種目前保存于海軍軍醫(yī)大學藥學院海洋藥物研究中心備查(菌株編號 33)。菌株接種至20 L Biomalt瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)28 d得到真菌發(fā)酵物。

1.2 主要儀器和試劑

儀器：制備HPLC [DAD檢測器](美國Aglient公司)，DRX 500核磁共振儀(瑞士Bruker公司)，高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)。

試劑：α-MEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，滅活胎牛血清(美國Thermo Fisher Scientific公司)，巨噬細胞集落刺激因子、核因子kB受體活化因子配基、抗酒石酸酸性磷酸酶(美國R&D公司)。

1.3 提取與分離

真菌經(jīng)28 d發(fā)酵后，加入乙酸乙酯對發(fā)酵物進行超聲萃取(5次)，合并萃取液，經(jīng)減壓濃縮得到粗浸膏10.7 g。采用正相硅膠柱層析，經(jīng)梯度洗脫[二氯甲烷-甲醇(80∶1 ～ 1∶1)]得到12個組分(Fr.1 ～ 12)。Fr.7經(jīng) Sephadex LH-20 凝膠柱層析[二氯甲烷-甲醇( 2 ∶1)]、正相硅膠柱層析[二氯甲烷-甲醇( 40∶1)]和制備HPLC[甲醇-水(70∶30)；流速∶2.0 ml/min]得化合物1(tR=21.0 min，13.3 mg)；Fr.9 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析[二氯甲烷-甲醇(2∶1)]、正相硅膠柱層析[二氯甲烷-甲醇(40∶1)]和制備HPLC[甲醇-水(63∶37)；流速∶2.0 ml/min]得到化合物2(tR=29.0 min，8.1 mg)和3(tR=32.5 min，5.0 mg)；Fr.10 經(jīng) Sephadex LH-20 凝膠柱層析[二氯甲烷-甲醇(2∶1)]、正相硅膠柱層析[二氯甲烷-甲醇(30∶1)]和制備HPLC[甲醇-水(75∶25)；流速∶2.0 ml/min]得化合物4(tR=19.0 min，18.2 mg)。

1.4 活性測試

從C57BL/6小鼠的股骨及脛骨分離出小鼠骨髓單核巨噬細胞(bone marrow macrophage cells,BMMs)，采用CCK-8法檢測化合物1-4對BMMs細胞毒性。檢測無毒性后，向BMMs中加入含有M-CSF(30 ng/ml)和RANKL(100 ng/ml)的α-MEM培養(yǎng)基，以受試化合物作為實驗組，不加化合物的為對照組，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，每48 h換一次含有化合物的培養(yǎng)基，并觀察細胞狀態(tài)。孵育5 ～ 6 d，當對照組出現(xiàn)成熟破骨細胞時，停止換液。使用TRAP染色，染色后在顯微鏡下觀察并拍照。采用Image J 圖像分析軟件對TRAP+ 面積進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，ESI-MS (m/z)∶402.26 [M+H]+，分子式為C24H35NO4。其NMR數(shù)據(jù)如下：1H-NMR (600M ,CDCl3)δ=3.08 (1H,dt,J=10.5,3.5 Hz,H-3),2.62 (1H,dd,J=5.0,3.5 Hz,H-4),2.34 (1H,brs,H-5),5.40 (1H,s ,H-7),2.41 (1H,brd,H-8),1,26,1.70 (2H,m,H-10),1.14 (3H,d,J=7.5 Hz,H-11),1.76 (3H,brd,H-12),2.84 (1H,dd,H-13),1.56,1.68 (2H,m ,H-15),1.72,1.96 (2H,m,H-16),3.78 (1H,brs,H-17),3.64 (1H,d,J=3.4 Hz,H-18),3.26 (1H,dd,J=9.0,9.0 Hz,H-19),2.52 (2H,d,J=9.0 Hz,H-20),1.55 (1H,m,H-22),0.91 (3H,d,J=6.5 Hz,H-23),0.94 (3H,d,J=6.5 Hz,H-24),1.19 (3H,s,H-25);13C-NMR (150M,CDCl3)δ=173.9 (C-1),52.1 (C-3),52.0 (C-4),35.2 (C-5),139.9 (C-6),127.3 (C-7),36.7 (C-8),64.3 (C-9),47.6 (C-10),13.8 (C-11),20.4(C-12),44.5 (C-13),82.1 (C-14),38.7 (C-15),27.0 (C-16),68.1 (C-17),83.5 (C-18),36.4 (C-19),43.0 (C-20),210.9 (C-21),25.4 (C-22),21.3 (C-23),24.0 (C-24),22.7 (C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道一致，確定化合物1為trichalasin H。

化合物2：白色粉末，ESI-MS (m/z)∶420.27 [M+H]+，分子式為C24H37NO5。其NMR數(shù)據(jù)如下：1H-NMR (600M,CDCl3)δ=3.07 (1H,dt,J=10.5,3.4 Hz,H-3),2.63 (1H,t,J=4.5 Hz,H-4),2.34 (1H,m,H-5),5.40 (1H,s,H-7),2.40 (1H,m,H-8),1.27,1.68 (2H,m,H-10),1.14 (3H,d,J=7.2 Hz,H-11),1.75 (3H,s,H-12),2.95 (1H,m,H-13),2.53,2.95 (2H,m,H-15),1.41,1.88 (2H,dd,td,J=13.2,5.0 Hz,J=13.1,4.6 Hz,H-16),1.71,2.01 (2H,m,H-17),3.55 (1H,brs,H-18),2.53 (1H,m,H-19),3.69 (1H,s,H-20),1.56 (1H,m,H-22),0.92 (3H,d,J=6.5 Hz,H-23),0.89 (3H,d,J=6.5 Hz,H-24),1.21 (3H,s,H-25);13C-NMR (150M,CDCl3)δ=174.0 (C-1),52.1 (C-3),51.9 (C-4),35.3(C-5),140.0 (C-6),127.2 (C-7),36.5 (C-8),64.4 (C-9),47.6 (C-10),13.7 (C-11),20.4 (C-12),39.0 (C-13),82.8 (C-14),42.7 (C-15),35.2 (C-16),24.8 (C-17),66.8 (C-18),42.8 (C-19),84.3 (C-20),210.3 (C-21),25.3 (C-22),24.0 (C-23),21.3 (C-24),23.4 (C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道一致，確定化合物2為aspergilluchalasin。

化合物3：白色粉末，ESI-MS (m/z)∶418.60 [M+H]+，分子式為C24H35NO5。其NMR數(shù)據(jù)如下：1H-NMR (600M,CD3OD)δ=3.21 (1H,m,H-3),2.89 (1H,dd,J=3.0,5.1 Hz,1H),3.04 (1H,brs,H-5),5.25 (1H,brs,H-7),3.82 (1H,d,J=11.1 Hz,H-8),1.47,1.71 (2H,m,H-10),1.25 (3H,d,J=7.3 Hz,H-11),1.76 (3H,m,H-12),6.15 (1H,dt,J=10.8,1.6 Hz,H-13),2.14,2.32 (2H,m,H-15),1.37,2.10 (2H,m,H-16),3.75 (1H,brd,J=5.4 Hz,H-17),4.46 (1H,s,H-18),7.25 (1H,dd,J=2.45,15.3 Hz,H-19),5.91 (1H,dd,J=2.45,15.3 Hz,H-20),1.70 (1H,m,H-22),0.94 (3H,d,J=6.0 Hz,H-23),0.94 (3H,d,J=6.0 Hz,H-24),1.37 (3H,brs,H-25);13C-NMR (150M,CD3OD)δ=175.3 (C-1),51.7 (C-3),53.5 (C-4),35.5 (C-5),141.5 (C-6),125.2 (C-7),41.1 (C-8),90.3 (C-9),50.0 (C-10),14.2 (C-11),19.7 (C-12),123.8 (C-13),140.5 (C-14),40.7 (C-15),28.4 (C-16),79.2 (C-17),74.4 (C-18),154.5 (C-19),120.5 (C-20),169.3 (C-21),25.7 (C-22),22.0 (C-23),24.1 (C-24),15.4(C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道一致，確定化合物3為aspochalasin I。

化合物4：白色粉末，ESI-MS (m/z)∶402.26 [M+H]+，分子式為C24H35NO4。其NMR數(shù)據(jù)如下：1H-NMR (600M,CDCl3)δ=3.14 (1H,ddd,J=9.5,3.0,3.0 Hz,H-3),3.03 (1H,dd,J=6.0,3.0 Hz,H-4),2.49 (1H,m,H-5),5.44 (1H,brs,H-7),2.90 (1H,d,J=10.5 Hz,H-8),1.20 (2H,m,H-10),1.23 (3H,d,J=6.0 Hz,H-11),1.75 (3H,brs,H-12),5.96 (1H,d,J=10.5 Hz,H-13),2.18 (2H,m,H-15),1.45,2.04 (2H,m,H-16),3.80 (1H,brs,H-17),4.56 (1H,s,H-18),6.40 (1H,dd,J=16.4,4.8 Hz,H-19),7.15 (1H,d,J=16.5 Hz,H-20),1.51 (1H,m,H-22),0.89 (3H,d,J=7.0 Hz,H-23),0.89 (3H,d,J=7.0 Hz,H-24),1.31 (3H,d,J=0.5 Hz,H-25);13C-NMR (150M,CDCl3)δ=175.0 (C-1),51.2 (C-3),49.7 (C-4),35.2 (C-5),140.5 (C-6),125.9 (C-7),43.7 (C-8),68.1 (C-9),48.5 (C-10),13.6 (C-11),20.0 (C-12),124.4 (C-13),137.4 (C-14),39.6 (C-15),29.5 (C-16),79.3 (C-17),75.7 (C-18),141.5 (C-19),129.8 (C-20),197.6 (C-21),25.2 (C-22),21.6 (C-23), 23.7 (C-24), 15.7 (C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道一致，確定化合物4為aspochalasin D。

2.2 活性測試結(jié)果

細胞毒性檢測結(jié)果表明，所有化合物在10 μmol/L濃度下對BMMs細胞沒有毒性。抑制破骨細胞分化結(jié)果顯示，在5 μmol/L和10 μmol/L濃度下，化合物3和4對BMMs向破骨細胞分化表現(xiàn)出不同程度的抑制(見圖2)。

圖2 化合物1～4抑制破骨細胞分化結(jié)果 A.TRAP+ 細胞面積統(tǒng)計；B.TRAP染色顯示破骨細胞形態(tài)(40×)；*P<0.05,**P <0.01，與對照組比較

3 討論

本次研究從東沙短足軟珊瑚共附生的黃柄曲霉中分離得到4個細胞松弛素類化合物。細胞松弛素在真菌中來源非常廣泛，在多個真菌屬中都有發(fā)現(xiàn)，包括曲霉屬[5,13](Aspergillussp.)，青霉屬[14](Penicilliumsp.)，團碳菌屬[15](Hypoxylonsp.)，莖點霉屬[16](Phomasp.)等。其結(jié)構(gòu)上都具有異吲哚酮駢合大環(huán)的結(jié)構(gòu)，主要變化集中在大環(huán)的取代基上。這類化合物具有多種生物活性，包括抗菌、抗腫瘤、抗HIV、自由基清除等[4,10-11,17]。文獻報道化合物1具有抗菌活性，同時對腫瘤細胞HL-60具有細胞毒性[10]；化合物3具有抑制黑色素生成作用[11]；化合物4具有誘導IL-3依賴的Ba/F3細胞凋亡活性[12]；化合物3和4都對腫瘤細胞THP1、HL-60、PC3具有較弱的細胞毒性[18]。

研究表明，在骨骼形成和發(fā)育過程中，破骨細胞和成骨細胞處于相互協(xié)調(diào)的動態(tài)平衡狀態(tài)。當破骨細胞數(shù)量增加，破骨功能增強時，這一平衡將被打破，會造成骨質(zhì)疏松，增加骨折風險等骨代謝疾病[19-20]。本研究中測試了這4個化合物對破骨細胞分化的抑制活性，發(fā)現(xiàn)化合物3和4對破骨細胞分化有一定程度的抑制活性，可以減少破骨細胞的生成。表明這兩個化合物對新型抗骨質(zhì)疏松藥物的研究具有重要意義。本文是對化合物3和4抑制破骨細胞分化活性的首次報道。化合物3和4在結(jié)構(gòu)上都含有C-13,14和C-19,20雙鍵，推測活性的存在可能與這兩個位置的雙鍵有關(guān)。