二氯乙酸鈉對氧糖剝奪損傷的BV2細胞的保護作用及其機制研究

趙 輝，章越凡，李鐵軍,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院 ，安徽 合肥 230012；2.海軍軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室，上海200433；3.上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院藥劑科，上海200125)

缺血性卒中是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，是導致死亡的主要原因[1]。膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)的天然免疫效應細胞，參與一系列神經(jīng)退行性病變[2]?；罨男∧z質(zhì)細胞釋放促炎因子以及細胞毒性因子(如NO和ROS)，導致神經(jīng)元損傷[3]。研究表明，小膠質(zhì)細胞激活誘發(fā)的炎癥反應參與了腦卒中的損傷過程[4]。二氯乙酸鈉(DCA)是一種可口服吸收的小分子化合物，臨床上可用于治療線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作(MELAS)綜合征、先天性乳酸性酸中毒和其他疾病的兒童[5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，DCA通過抑制 PDK2和減少冠狀動脈肌內(nèi)膜增生而起到潛在的血管保護作用[6]，并促進腦缺血后的腦再生[7]。筆者使用 BV2細胞的OGD損傷模型，探討DCA治療是否具有保護作用及其可能的作用機制。

1 材料

1.1 細胞株

BV2細胞購自中科院上海細胞庫，培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中(37℃，5% CO2)，每48 h更換培養(yǎng)基并傳代。

1.2 藥物與試劑

二氯乙酸鈉(DCA，TCI公司，貨號：D1719)； DMEM完全培養(yǎng)基、DMEM無糖培養(yǎng)基 (Gibco 公司)；凋亡檢測試劑盒、NO試劑盒、ROS試劑盒、蛋白質(zhì)提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司) ；抗體:β-actin， SAPK/JNK， P-SAPK/JNK， I-κB， P-I-κB， stat3， P-stat3， NF-κB， P-NF-κB (CST公司)。

1.3 儀器

細胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司)；高速水平離心機 (Eppendorf公司)；缺氧裝置(Billups-Rothenberg 公司)；酶標儀(Thermo 公司)；流式細胞儀 (BD Biosciences公司); Western blot 圖像掃描儀(Odyssey公司)。

2 方法

2.1 OGD 模型的建立

參考文獻[8]建立體外模擬腦缺血模型，即OGD模型，并根據(jù)本實驗目的稍作修改。細胞接種在細胞培養(yǎng)板中。細胞貼壁后，對照組更換為不含血清的DMEM，OGD組用無糖 DMEM培養(yǎng)基，DCA給藥組更換為加有 DCA的無糖 DMEM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中適應1 h，然后置于缺氧裝置中，通入混合氣(95%N2、5% CO2)密閉后，置于培養(yǎng)箱中，1～4 h后取出細胞，做后續(xù)處理。

2.2 CCK8法測定細胞活力

將BV2細胞以1.2×105個/ml的密度接種于96孔板中，按照“2.1”項下操作方法，在 OGD之前將給藥組更換為加入不同濃度的二氯乙酸鈉( 1、10、100、400、800 μmol/L)適應性培養(yǎng)1 h，OGD組和給藥組置于缺氧裝置中OGD 4 h后，采用 CCK-8法檢測細胞活力， 用酶標儀測定450 nm處上述不同濃度組的吸光度值(A)。

2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

以1.0×106個/ml的密度將 BV2細胞接種于6孔板中，分為對照組、OGD組和給藥組，細胞貼壁后，OGD組更換為無糖 DMEM培養(yǎng)基，給藥組更換為加有DCA的無糖 DMEM培養(yǎng)基，適應性培養(yǎng)1 h后，OGD組和給藥組置于缺氧裝置中OGD 4 h，之后分別收集各組細胞，使用凋亡試劑盒對細胞進行處理，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS和NO的表達

以1.0×106個/ml的密度將 BV2細胞接種于6孔板中，細胞貼壁后，OGD組更換為無糖 DMEM培養(yǎng)基，給藥組更換為加有DCA的無糖 DMEM培養(yǎng)基，適應性培養(yǎng)1 h后，OGD組和給藥組置于缺氧裝置中OGD 4 h，之后分別收集各組細胞，按照相應的ROS和NO檢測試劑盒說明書對細胞進行前處理，流式細胞術(shù)檢測ROS和NO含量。

2.5 Western blot 檢測蛋白表達

以1.0×106個/ ml的密度將 BV2細胞接種于6孔板中，細胞貼壁后，OGD組更換為無糖 DMEM培養(yǎng)基，給藥組更換為加有DCA的無糖 DMEM培養(yǎng)基，然后 OGD 4 h， 結(jié)束后分別收集各組細胞，置于 預冷的RIPA裂解液中裂解30 min，離心，取上清液。BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，將硝酸纖維素膜用含有5%脫脂奶粉的 Tris緩沖液封閉2 h， 4 ℃環(huán)境下一抗孵育過夜，棄去一抗，漂洗3次(5 min/次)，室溫下與二抗孵育1 h后洗滌膜。使用Western blot 圖像掃描儀進行掃描統(tǒng)計。

2.6 統(tǒng)計分析

使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標準差)表示。t檢驗用于組間比較，P<0.05時表示有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 DCA對OGD誘導的 BV2 細胞損傷的保護作用

OGD 1～4 h后，細胞生存率顯著降低，與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，以 OGD 4 h為最佳時間(圖1A)。DCA濃度為400 μmol/L可顯著提高 OGD 4 h后的細胞活力(P<0.01)，因此選擇 OGD 4 h，給藥濃度400 μmol/ L作為后續(xù)試驗條件(圖1B)。

圖1 DCA對OGD誘導BV2細胞損傷的影響 A.不同的OGD時間；B.不同的DCA濃度(μmol/L)*P<0.05,**P<0.01,與對照組比較；##P<0.01,與OGD組比較

3.2 DCA降低OGD誘導的 BV2 細胞凋亡

為了考察DCA對 OGD 損傷的BV2細胞凋亡的影響，本研究采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。結(jié)果顯示(圖2)，與對照組相比， OGD誘導細胞的凋亡率增加，由對照組(2.62±0.22)%上升到(8.55±0.37)%(P<0.01)，而DCA可顯著減少細胞凋亡，凋亡率降至(3.95±0.16)% (P<0.01)。

3.3 DCA降低OGD誘導的BV2細胞中ROS和NO的含量

與對照組相比， OGD提高了BV2細胞中ROS和NO的含量 (P<0.01); 而DCA可顯著降低BV2細胞內(nèi)ROS(P<0.01)和NO(P<0.05)的含量(圖3)。

3.4 DCA 對 NF-κB/STAT3信號通路的調(diào)節(jié)作用

NF-KB信號通路廣泛參與凋亡、炎癥反應，因此本研究檢測了 DCA對該信號通路的影響。結(jié)果如圖4A和圖4B所示， OGD損傷后 P-NF-κB、 P-JNK及 P-I-κB的表達水平均顯著升高(P<0.01)； DCA可顯著下調(diào) OGD誘導的P-NF-κB，P-JNK(P<0.05)及 P-I-κB蛋白的升高(P<0.01)。而 STAT3在腦卒中血管生成方面起到重要作用， OGD后 P-STAT3表達顯著上調(diào)(P<0.01)，而 DCA治療組 P-STAT3表達顯著降低(P<0.05)。

圖2 DCA對OGD誘導的 BV2 細胞凋亡率的影響 A.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況；B.細胞凋亡比例 **P<0.01,與對照組比較；##P<0.01,與OGD組比較(n=3)

圖3 DCA對OGD誘導的 BV2 細胞內(nèi)ROS和NO含量的影響 A.流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS含量；B.ROS含量統(tǒng)計圖；C.流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)NO含量；D.NO含量統(tǒng)計圖**P<0.01,與對照組比較；#P<0.05,##P<0.01,與OGD組比較(n=3)

4 討論

卒中是由血管阻塞或出血引起的腦血液循環(huán)障礙并誘發(fā)腦神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，致死率較高，其病理機制復雜， 目前仍缺乏有效的治療方法，而炎癥反應已被證實為卒中誘發(fā)損傷中一個關(guān)鍵影響因素。小膠質(zhì)細胞的激活是誘發(fā)卒中炎癥反應的主要原因之一[9]，激活的小膠質(zhì)細胞在形態(tài)及功能上會發(fā)生明顯改變，并在炎癥部位產(chǎn)生大量的神經(jīng)毒素和促炎癥介質(zhì)， 從而導致神經(jīng)元損傷，并且會釋放促炎因子和細胞毒性因子，如IL-1、IL-6、TNF-α、NO和ROS[4]。因此，降低小膠質(zhì)細胞的激活以及抑制其細胞毒性因子的釋放對神經(jīng)元的保護具有重要作用。

圖4 DCA 對OGD誘導下BV2細胞 NF-κB/STAT3通路的影響 A.Western blotting檢測JNK、NF-κB、I-κB、STAT3及其磷酸化蛋白的表達水平；B.p-JNK/JNK比值；p-NF-κB/NF-κB比值；p-I-κB/I-κB比值；p-STAT3/STAT3比值**P<0.01,與對照組比較；#P<0.05,##P<0.01,與OGD組比較(n=3)

最新研究表明， DCA在血管保護和促進血管內(nèi)皮修復中起著重要作用[6]，可以改善動脈粥樣硬化患者的血管鈣化[10]。然而，DCA對小膠質(zhì)細胞激活引起的炎癥反應的作用尚無研究報道。 本實驗研究了DCA對OGD誘導的BV2小膠質(zhì)細胞凋亡和炎癥反應的抑制作用，并初步探討其可能的機制。首先建立 OGD損傷BV2細胞模型，同時加入不同濃度的DCA進行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DCA可劑量依賴性地抑制 OGD介導的BV2細胞損傷，并且當 DCA濃度為400 μmol/L時抑制作用最強。于是，筆者選擇400 μmol/L給藥劑量進行機制探討。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過OGD損傷，BV2細胞凋亡明顯增加并且細胞內(nèi) ROS和 NO水平顯著升高， 而 DCA可顯著抑制細胞凋亡并下調(diào)細胞內(nèi)ROS、 NO的水平， 提示DCA可能通過抑制BV2細胞激活后ROS和NO的水平發(fā)揮神經(jīng)保護活性。為進一步探討 DCA是否通過抗炎作用發(fā)揮對小膠質(zhì)細胞的保護作用，筆者對 JNK、 I-κB和 NF-κB的蛋白表達， I-κB磷酸化水平以及 NF-κB磷酸化水平進行檢測。NF-κB作為促炎因子基因表達的最主要調(diào)節(jié)者之一[11]，與腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)炎癥的發(fā)生及小膠質(zhì)細胞激活密切相關(guān)[12]。 I-κB是 NF-κB信號通路的重要組成，正常情況下，I-κB和NF-κB形成復合體存在于胞質(zhì)中。當受到胞外信息刺激時， I-κB發(fā)生磷酸化并被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，導致 NF-κB p65核結(jié)合位點暴露并使之發(fā)生核轉(zhuǎn)位， NF-κB p65入核后與相關(guān)免疫基因結(jié)合進而促進這些基因轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果顯示，OGD誘導的 BV2 細胞激活伴隨JNK、I-κB 、NF-κB磷酸化水平的增加； 而DCA處理可顯著抑制上述改變。結(jié)合 DCA對 OGD所致BV2細胞激活后 ROS、 NO表達的降低，表明DCA可能通過抑制 JNK/I-κB/ NF-κB信號通路的激活，進而抑制 OGD誘導的BV2細胞炎癥反應，最終發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

本研究結(jié)果表明，DCA能夠顯著抑制 OGD誘導的BV2細胞凋亡并且可以減少細胞內(nèi)ROS和NO的水平，并通過調(diào)控NF-κB/STAT3信號通路產(chǎn)生抗炎及神經(jīng)保護作用。DCA可能在腦缺血中對小膠質(zhì)細胞引起的損傷具有保護作用。進一步的研究需要在腦缺血動物模型上更深入地解釋DCA對腦缺血的影響及其作用機制，為DCA在臨床用于缺血性腦卒中的治療提供藥理學理論基礎(chǔ)。