miR-122和VEGF在膠質(zhì)瘤患者中表達(dá)的臨床意義

唐玉蓉 成立峰 于本章

(勝利油田中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，東營(yíng)257000)

膠質(zhì)瘤是臨床備受關(guān)注的腦腫瘤之一，是最常見和具有侵襲性的腦腫瘤，發(fā)病率占腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%以上。世界衛(wèi)生組織(World health organization，WHO)據(jù)惡性程度將其分為低級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅰ～Ⅱ級(jí))及高級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅲ～Ⅳ級(jí))，Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤患者的中位生存期為5～10年，Ⅲ級(jí)腫瘤患者的中位生存期為3～5年。其中高級(jí)別膠質(zhì)瘤高發(fā)(占75%以上)且惡性程度高，病情進(jìn)展迅速并存在較高的復(fù)發(fā)率[1]。因此，臨床上迫切需要早期診斷方法和明確疾病的發(fā)生機(jī)制。本研究通過檢測(cè)miR-122在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，探討其在膠質(zhì)瘤診斷中的作用，以便為膠質(zhì)瘤的診療提供理論依據(jù)。同時(shí)檢測(cè)血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)含量，探討miR-122與VEGF在疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本 自2014年4月到2016年4月，在勝利油田中心醫(yī)院神經(jīng)外科收集74例膠質(zhì)瘤患者(膠質(zhì)瘤組)和74例健康人(對(duì)照組)。所有膠質(zhì)瘤患者均于術(shù)前清晨空腹采集3 ml靜脈血和5 ml EDTA抗凝血液標(biāo)本，對(duì)照組清晨空腹采集3 ml靜脈血和5 ml EDTA抗凝血液標(biāo)本。3 ml靜脈血分離血清后，-20℃保存?zhèn)溆?，用于VEGF檢測(cè)；5 ml EDTA抗凝血在2 h內(nèi)處理， 1 500 r/min離心10 min。上清液移至無RNA酶的試管，進(jìn)一步在4℃下以12 000 r/min離心10 min，以除去細(xì)胞碎片。將上清血漿在-80℃儲(chǔ)存，用于miR-122檢測(cè)。

1.1.2試劑與儀器 TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，NanoDrop ND1000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，Waltham，Mass，USA)，miRcutemiRNAcDNA第一條鏈合成試劑盒(Tiangen，Beijing，China)，miR-122和U6引物購(gòu)自GenePharma(中國(guó)上海)。ELISA檢測(cè)試劑盒(注冊(cè)證編號(hào)：魯械注準(zhǔn)20142400165)。

1.2方法

1.2.1RNA提取和定量逆轉(zhuǎn)錄PCR 根據(jù)試劑操作說明書，使用TRIzol試劑從血漿中提取總RNA。使用分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA含量和濃度。使用miRcutemiRNAcDNA第一條鏈合成試劑盒將血漿中的RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，并使用miRcutemiRNAqPCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-122的表達(dá)水平。將U6作為內(nèi)參。實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析，最終體現(xiàn)為目的基因誘導(dǎo)倍數(shù)的差異。

1.2.2ELISA 檢測(cè)VEGF濃度 嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中VEGF濃度。

圖1 miR-122在膠質(zhì)瘤患者和對(duì)照組中的表達(dá)Fig.1 miR-122 expression was detected by qRT-PCR in glioma and control groupsNote: Compared with the control group,*.P<0.05.

2 結(jié)果

2.1miR-122在血漿中表達(dá) 通過qRT-PCR檢測(cè)血漿中miR-122表達(dá)(圖1)。結(jié)果顯示，miR-122在膠質(zhì)瘤和對(duì)照組中的相對(duì)定量表達(dá)分別為0.68±0.339和1.66±0.550。 miR-122在膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

2.2miR-122對(duì)膠質(zhì)瘤的診斷性能 通過ROC曲線分析miR-122在膠質(zhì)瘤中的診斷性能。在cut off為1.225時(shí)，靈敏度為91.9%，特異度為81.1%，AUC為0.939(圖2)。

2.3miR-122與膠質(zhì)瘤的臨床病理特征相關(guān)性分析 本研究中miR-122與臨床病理特征的相關(guān)性列于表1中。根據(jù)miR-122中位值(0.61)將膠質(zhì)瘤患者分為兩組：低表達(dá)組(<0.61)和高表達(dá)組(≥0.61)。miR-122表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小或手術(shù)切除方法無相關(guān)性(P>0.05)，而與WHO分級(jí)顯著相關(guān)。

圖2 miR-122對(duì)膠質(zhì)瘤診斷性能的ROC曲線Fig.2 ROC curve for diagnostic performance of miR-122 for gliomas

表1 miR-122 與膠質(zhì)瘤病理特征相關(guān)性分析

Tab.1 Correlation between miR-122 and clinicopatholog-ical features of glioma

ClinicopathologicalfeaturesnmiR-122 expressionLow group(n=37)High group(n=37)PGender0.816Male392019Female351718Age(year)0.816≥50351817<50391920Tumor size0.102<5 cm412417≥ 5 cm331320WHO grade<0.001Ⅰ14014Ⅱ17215Ⅲ20128Ⅳ23230

表2 miR-122和VEGF在對(duì)照組和世衛(wèi)組織Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)

Tab.2 Expression of miR-122 and VEGF in control group and WHO Ⅰ-Ⅳ grade

WHO gradeⅠⅡⅢⅣControl groupmiR-122 expression1.22±0.161)0.80±0.171)0.59±0.111)0.35±0.111)1.66±0.55VEGF concentration (pg/ml)65.11±6.0870.23±6.21147.85±14.221)176.51±15.711)63.70±6.50

Note：Compared with the control group，1)P<0.05.

2.4miR-122和VEGF在對(duì)照組和Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中表達(dá) miR-122和VEGF表達(dá)結(jié)果如表2所示，與對(duì)照組相比，Ⅰ～Ⅳ級(jí)miR-122的表達(dá)均顯著降低。此外，miR-122表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤的分級(jí)增加而降低，具有顯著性差異。與對(duì)照組相比，Ⅰ～Ⅳ級(jí)VEGF濃度隨著膠質(zhì)瘤分級(jí)的增加而升高，Ⅲ～Ⅳ升高具有顯著性差異。miR-122和VEGF在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

目前，膠質(zhì)瘤的診斷主要依靠CT和核磁共振，費(fèi)用昂貴阻礙其成為常規(guī)診斷、篩選手段。因此，需要一種便宜、快速、高效的膠質(zhì)瘤篩選工具。miRNA是一類20～24 nt的小分子RNA片段，其無開放閱讀框，不編碼蛋白質(zhì)，但卻可通過多種表觀遺傳調(diào)控方式影響細(xì)胞增殖、凋亡、分化和侵襲[2]。隨著表觀遺傳與腫瘤關(guān)系研究的深入，miRNAs表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)，可以在癌癥中發(fā)生顯著變化，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。許多研究已經(jīng)證明miRNA失調(diào)可以作為診斷和預(yù)后標(biāo)記[4-6]。

miR-122是肝臟富含的腫瘤抑制因子，在肝細(xì)胞癌中表達(dá)受到抑制，靶向WNT1并沉默WNT信號(hào)通路，促進(jìn)肝細(xì)胞癌[7]。miR-122在膀胱癌中和乳腺癌中表達(dá)也下調(diào)[8,9]。最近，Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-122通過靶向WNT1抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲，其在膠質(zhì)瘤患者中表達(dá)下調(diào)。然而，miR-122對(duì)膠質(zhì)瘤診斷的影響尚不清楚。在本研究中，我們分析了膠質(zhì)瘤患者血漿中miR-122的表達(dá)，并評(píng)估m(xù)iR-122在膠質(zhì)瘤診斷中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，膠質(zhì)瘤患者血漿中miR-122的表達(dá)下調(diào)。ROC曲線分析顯示miR-122在診斷膠質(zhì)瘤時(shí)敏感度和特異度高。研究表明，血漿miR-122是診斷膠質(zhì)瘤潛在的生物標(biāo)志物。此外，miR-122的表達(dá)水平與WHO分級(jí)顯著相關(guān)，隨膠質(zhì)瘤的進(jìn)展而降低。Wang等[10]發(fā)現(xiàn)miR-122表達(dá)在膠質(zhì)瘤中下調(diào)，表達(dá)較高的患者存活率較高。miR-122超表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲[11]，此結(jié)果間接反映了miR-122對(duì)膠質(zhì)瘤的診斷價(jià)值。

VEGF是促進(jìn)腫瘤血管生成的關(guān)鍵刺激因子，幾乎參與腫瘤血管生成的每個(gè)環(huán)節(jié)[12]。目前研究表明，較多的實(shí)體瘤腫瘤組織高表達(dá)VEGF，被認(rèn)為是惡性腫瘤的主要刺激因子。本研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組的VEGF表達(dá)水平比對(duì)照組高，Ⅲ和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組的VEGF表達(dá)水平與Ⅰ、Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤組相比顯著升高(P<0.05)，說明VEGF不僅在腫瘤瘤體內(nèi)升高，同樣在Ⅲ、Ⅳ級(jí)腫瘤患者體內(nèi)也異常高表達(dá)。VEGF在低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中含量較低，與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與腫瘤細(xì)胞早期血管無明顯增生相關(guān)，所以刺激釋放的VEGF水平也偏低。在高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中，部分腫瘤血管異常增生，出現(xiàn)壞死，蛋白釋放入血，VEGF濃度升高。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-122和VEGF之間呈負(fù)相關(guān)性，驗(yàn)證了隨著miR-122的降低，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路受抑降低，膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲抑制減弱，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖，可表現(xiàn)為VEGF濃度增高，加速腫瘤血管形成，腫瘤細(xì)胞過度增殖，腫瘤形成。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-122表達(dá)的最佳截止值為1.225，敏感度為91.9%，特異度為81.1%，AUC為0.939，是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在診斷生物標(biāo)志物。為了促進(jìn)組織特異度和敏感度，我們將在未來的研究中研究miR-122以及其他miRNA或基因用于診斷膠質(zhì)瘤。miR-122表達(dá)的降低，VEGF的升高，為膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)，但本研究例數(shù)較少，且為單中心研究，故結(jié)論需要大樣本、多中心的研究來進(jìn)一步證實(shí)。