黃連素對高糖培養(yǎng)下大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞增殖的影響

金軼平，朱皓皓

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥，是成年人失明的首要原因[1]。目前，治療DR的方法主要有激光光凝、玻璃體切割手術(shù)以及抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)藥物或糖皮質(zhì)激素等藥物的運用，但這些方法并不能完全阻止DR的發(fā)展，因此更多有效的治療方法有待發(fā)現(xiàn)和研究[2]。Müller神經(jīng)膠質(zhì)細胞是視網(wǎng)膜中數(shù)量最多的細胞，位于視網(wǎng)膜神經(jīng)和血管之間，為視網(wǎng)膜提供結(jié)構(gòu)和神經(jīng)營養(yǎng)支持，具有調(diào)節(jié)突觸發(fā)育、神經(jīng)血管耦合、電解質(zhì)平衡和細胞代謝等多種生理功能，在維持視網(wǎng)膜組織的健康和結(jié)構(gòu)完整性方面具有至關(guān)重要的作用[3-4]。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)在視網(wǎng)膜中只存在于Müller細胞中，為Müller細胞特異性標記。黃連素作為我國應用已久的傳統(tǒng)中藥，可從黃連等多種植物中提取，亦可人工合成，對于糖尿病腎病、糖尿病性神經(jīng)病、心腦血管疾病等多種糖尿病并發(fā)癥均有明確的抑制和改善作用[5-8]。本研究以25mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基模擬高糖狀態(tài)，用不同濃度黃連素作用于大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞，研究黃連素對高糖培養(yǎng)下Müller細胞增殖的影響，探討黃連素在DR治療中的可能作用。

圖1 大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞形態(tài)觀察(×100) A：原代培養(yǎng)3d，視網(wǎng)膜組織塊周圍不斷有視網(wǎng)膜細胞爬出，貼壁細胞形態(tài)多樣，呈梭形、多角形、不規(guī)則形，突起可有多條；B：原代培養(yǎng)10d，細胞融合。

1材料和方法

1.1材料實驗動物：出生4～7d的Sprague Dawley(SD)大鼠(雌雄不限，SPF級)購自上海斯萊克實驗動物有限公司。主要試劑：黃連素[美國 Sigma公司，14050，≥90%(AT)，分子量371.81，C20H18ClNO4·xH2O]，DMSO(美國Sigma公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，RPMI-1640(美國Hyclon公司)，青鏈霉素混合液(100×)、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(美國Solarbio公司)，CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(美國SAB公司)，兔抗鼠GS抗體(美國Abcam公司，Ab49873)，F(xiàn)ITC標記山羊抗兔IgG抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，A0562)、DAPI(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。主要儀器設(shè)備：酶標分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。本研究獲得復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞的原代培養(yǎng)和傳代出生4～7d的SD大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后取出眼球，在碘伏及含100U/mL青鏈霉素混合液的D-Hank液中各浸泡10min，D-Hank液沖洗，去除眼球外筋膜組織，沿角膜緣后1mm剪開眼球壁，去除眼前節(jié)及玻璃體，分離視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜剪成小碎片，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化20min，吸管吹打，用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，銅網(wǎng)過濾，將過濾液離心，棄上清液，沉淀物加細胞培養(yǎng)液吹打稀釋，接種于塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每3d換液1次，去除懸浮細胞，待細胞貼壁達到80%融合后按1∶2傳代。本實驗所用細胞為傳至2代細胞。

1.2.2大鼠Müller細胞的鑒定取第2代細胞接種于放置經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片的六孔板內(nèi)，細胞貼壁后棄培養(yǎng)液，用PBS液清洗，4%多聚甲醛固定10min，PBS液清洗，0.5% Triton穿孔15min，PBS液清洗，5%山羊血清封閉30min，加GS一抗(1∶200)，4℃過夜，PBS液漂洗，加山羊抗兔FITC二抗(1∶500)37℃雜交1h，PBS液漂洗，加DAPI染核，PBS液漂洗，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 Müller細胞分組預先將黃連素溶解于50mmol/L DMSO溶液中，調(diào)整各組中黃連素濃度，同時保證各組中DMSO濃度≤0.05%。將處于對數(shù)生長期的大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞分為正常糖濃度(5mmol/L)組、高糖濃度(25mmol/L)組、高糖+5μmol/L黃連素組、高糖+10μmol/L黃連素組、高糖+25μmol/L黃連素組、高糖+50μmol/L黃連素組和高糖+100μmol/L黃連素組。

1.2.4 CCK-8法檢測Müller細胞增殖活性對數(shù)生長期的細胞經(jīng)胰酶消化，在顯微鏡下計數(shù)后制成3×104個/mL的細胞懸液。接種至96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，每組設(shè)3個復孔，置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72h后，按1∶10體積比混合CCK-8溶液和無血清培養(yǎng)基，每孔100μL加入待測孔中，培養(yǎng)箱中孵育1h后，用酶標儀測定在450nm波長處的吸光度(A)值并記錄。

2結(jié)果

2.1大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞形態(tài)觀察大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞原代培養(yǎng)24h后，部分視網(wǎng)膜細胞貼壁；2～3d后視網(wǎng)膜組織塊周圍不斷有視網(wǎng)膜細胞爬出，首次換液去除未貼壁細胞及懸浮組織，貼壁細胞形態(tài)多樣，呈梭形、多角形、不規(guī)則形，突起可有多條；7～10d原代細胞不斷增生融合，生長抑制，細胞開始老化，此時予以傳代，傳代后第2、3代細胞生長活躍，細胞形態(tài)較一致，呈梭形、多角形、不規(guī)則形，可有數(shù)條突起，傳至第4代后細胞老化明顯，呈成纖維細胞樣改變(圖1)。

2.2大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞的鑒定本研究培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞GS表達陽性率達90%以上，幾乎所有細胞的細胞漿內(nèi)均表達GS，細胞核周圍局部可見點狀高熒光聚集；DAPI染色顯示Müller細胞核完整，呈藍色熒光(圖2)。

2.3黃連素對高糖培養(yǎng)下Müller細胞增殖的影響CCK-8

表1 不同濃度黃連素處理不同時間對大鼠Müller細胞增殖的影響

注：aP<0.05，bP<0.01vs同一時間正常糖濃度組；cP<0.05，dP<0.01vs同一時間高糖濃度組；eP<0.05，fP<0.01vs同一時間高糖+5μmol/L黃連素組；gP<0.05，hP<0.01vs同一時間高糖+10μmol/L黃連素組。

檢測結(jié)果(表1)顯示，正常糖濃度組、高糖濃度組、高糖+5μmol/L黃連素組、高糖+10μmol/L黃連素組、高糖+25μmol/L黃連素組、高糖+50μmol/L黃連素組和高糖+100μmol/L黃連素組細胞分別培養(yǎng)24、48、72h吸光度值比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與正常糖濃度組相比，高糖濃度組細胞分別培養(yǎng)24、48、72h吸光度值均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與高糖濃度組相比，培養(yǎng)24h時，10、25、50、100μmol/L黃連素組細胞吸光度值明顯上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；培養(yǎng)48h時，5μmol/L黃連素組細胞吸光度值無明顯變化，10、25、50、100μmol/L黃連素組細胞吸光度值均明顯上升，且25、50、100μmol/L黃連素組細胞吸光度值組間均無明顯差異，但均高于5μmol/L黃連素組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；培養(yǎng)72h時，5μmol/L黃連素組細胞吸光度值仍無明顯變化，10、25、50、100μmol/L黃連素組細胞吸光度值均明顯上升，且均高于5μmol/L黃連素組，而25、50、100μmol/L黃連素組細胞吸光度值組間無明顯差異，但均高于10μmol/L黃連素組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明黃連素能促進高糖條件下Müller細胞的增殖活性。

2.4黃連素濃度與高糖培養(yǎng)下Müller細胞增殖的關(guān)系不同濃度黃連素組細胞培養(yǎng)72h的吸光度值與黃連素濃度呈正相關(guān)(r=0.7890，P<0.001)，見圖3，表明高糖環(huán)境下，隨著黃連素濃度的增加，Müller細胞的增殖活性逐漸增強，高糖誘導細胞活性降低的效應逐漸減弱。

3討論

圖2 大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞的鑒定(×200) 綠色表示大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞GS陽性表達；藍色表示細胞核DAPI染色結(jié)果。

Müller細胞在高糖環(huán)境下尤其容易受到損傷，被認為是DR發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素[9]。大量研究證實，體外高糖環(huán)境能夠誘導Müller細胞發(fā)生凋亡，細胞增殖活性減弱[10-12]。本研究采用25mmol/L濃度的葡萄糖培養(yǎng)基模擬糖尿病患者體內(nèi)的高糖狀態(tài)，培養(yǎng)SD大鼠Müller細胞后，利用CCK-8法檢測細胞增殖活性。CCK-8試劑中含有WST-8，其在電子載體(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚的量與活細胞的數(shù)量呈正比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖濃度組Müller細胞吸光度值顯著低于正常糖濃度組，提示高糖可導致細胞增殖活性降低，而25、50、100μmol/L黃連素組細胞吸光度值組間無明顯差異，表明上述三組細胞增殖活性無明顯差別，25μmol/L濃度的黃連素即可減輕高糖對大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞增殖的抑制作用。

圖3 黃連素濃度與高糖培養(yǎng)下Müller細胞吸光度值的關(guān)系。

黃連素藥源廣泛，價格低廉，具有降脂、降血糖、抗氧化、抗炎等多重作用[13-16]。研究表明，黃連素可以減輕由高糖、高脂誘導的人內(nèi)皮細胞損傷，提高細胞存活率[16]，還可顯著抑制由鏈脲佐菌素誘導的小鼠胰島細胞死亡[17]。高度氧化糖化的低密度脂蛋白(HOG-LDL)可顯著降低人視網(wǎng)膜Müller細胞的活性，而黃連素可有效抑制HOG-LDL誘導的細胞損傷[18]。但黃連素對單一高糖作用下Müller細胞的作用效果及與其濃度的關(guān)系仍有待于進一步研究。本研究所采用的黃連素需溶解于DMSO溶液中，而DMSO具有一定的細胞毒性，含濃度為0.2% DMSO的培養(yǎng)液會抑制人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19)的增殖，而含濃度為0.05% DMSO的培養(yǎng)液則對細胞增殖無明顯影響[19]。為排除DMSO的干擾，本研究不同濃度黃連素組中的DMSO濃度≤0.05%，在高糖培養(yǎng)基中同時加入不同濃度(5、10、25、50、100μmol/L)黃連素培養(yǎng)Müller細胞發(fā)現(xiàn)，10μmol/L濃度黃連素即可有效抑制由高糖導致的細胞活性降低，且隨著黃連素濃度的增加，作用效果逐漸加強，這與既往研究表明0～20μmol/L黃連素能夠抑制細胞凋亡，且具有明顯的濃度和時間依賴性[18-19]的結(jié)果一致。

氧化應激是糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的共同致病機制。體外高糖環(huán)境可使Müller細胞產(chǎn)生氧化應激反應，從而降低細胞活性。研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)可結(jié)合抗氧化反應元件誘導內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)蛋白的表達，在Müller細胞氧化應激反應中具有重要作用[20]。Nrf2激活劑dh404不僅能減少氧誘導的視網(wǎng)膜病變中Müller細胞的膠質(zhì)增生，同時通過增加Nrf2反應性抗氧化物減少缺氧誘導的Müller細胞中活性氧(ROS)及血管生成因子的升高[21]。Nrf2激活劑RS9能減輕光誘導的Müller細胞死亡[22]。另有研究表明，黃連素能顯著降低糖尿病腎損傷大鼠的血糖水平和ROS、Kelch樣環(huán)氧丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)、還原型輔酶Ⅱ氧化酶4(NOX4)的水平，增強血清超氧化物歧化酶(SOD)活性以及Nrf2水平[23-24]。因此，黃連素可能通過調(diào)控Keap1-Nrf2/ARE信號通路緩解氧化應激，改善小鼠糖尿病腎病。黃連素還可明顯促進抗氧化相關(guān)蛋白Nrf2的表達，抑制Keap1的表達，從而抑制由缺氧再復氧造成的心肌細胞活力降低和凋亡增加[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連素能有效抑制高糖誘導的細胞活性降低，分析可能是通過調(diào)控Nrf2信號通路，緩解高糖誘導產(chǎn)生的氧化應激反應而發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，高糖會抑制Müller細胞增殖活性，而經(jīng)黃連素處理后可有效抑制由高糖誘導的細胞活性降低，且作用效果與黃連素濃度呈正相關(guān)，為黃連素應用于治療DR提供了一定的實驗依據(jù)。本研究后續(xù)將對黃連素0～50μmol/L濃度梯度內(nèi)，高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜Müller細胞凋亡、炎癥因子的變化、氧化應激反應及其相關(guān)作用機制和作用靶點做進一步探索。