miR-152-3p靶向IGF1基因?qū)Ω咛钦T導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞活性和凋亡的影響

李 博，陳金鵬，胡 璇，吳淑君，瞿文博

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其發(fā)病率隨著糖尿病發(fā)病率的升高而逐年上升。糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病常見的微血管病變之一，具有特異性改變的眼底，引起患者視力嚴(yán)重受損，影響著患者的身心健康[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變的特征是毛細(xì)血管周細(xì)胞早期丟失和基底膜增厚，這可能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖，并隨后導(dǎo)致血管生成[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能夠促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)毛細(xì)血管細(xì)胞通透性，參與糖尿病視網(wǎng)膜病變[3]。據(jù)報(bào)道，高葡萄糖可增加視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF蛋白水平，且糖尿病視網(wǎng)膜病變和其他與新生血管形成相關(guān)的眼部疾病中VEGF水平亦增加[4]。因此，通過了解其發(fā)展和進(jìn)展的分子機(jī)制，開發(fā)針對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的新型治療策略具有重要的意義。微小RNA(miRNA)是一類新的小型、高度保守的非編碼RNA，可作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。它們與靶mRNA的3’-UTR結(jié)合，并通過誘導(dǎo)mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA在糖尿病及其并發(fā)癥中發(fā)揮重要調(diào)控作用[6-7]。miR-152-3p屬于高度保守的miRNA家族，它調(diào)節(jié)血管生成因子的釋放，可能參與控制血管完整性和血管生成，這對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展至關(guān)重要[8-9]。胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)是與多種生物學(xué)特性相關(guān)的重要生長(zhǎng)因子，如細(xì)胞增殖、分化、存活和成熟等[10]。據(jù)報(bào)道IGF1參與視網(wǎng)膜增殖膜的發(fā)展，這是一層病理組織，是糖尿病視網(wǎng)膜病變非常重要的病理?xiàng)l件[11]。前期研究[12-13]發(fā)現(xiàn)miR-206通過靶向IGF1增強(qiáng)鼻咽癌的放射敏感性，miR-422a通過靶向IGF1抑制膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲。本研究前期通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)得到miR-152-3p與IGF1存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)確定了miR-152-3p與IGF1 mRNA直接相互作用，以調(diào)節(jié)高糖條件下ARPE-19細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。結(jié)果表明miR-152-3p及其靶向IGF1可能為糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療提供新的見解。

1材料和方法

1.1材料ARPE-19細(xì)胞株購自中國科學(xué)院武漢細(xì)胞庫；DMEM高糖和正常糖培養(yǎng)基、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；胎牛血清、Trizol試劑購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自杭州四季青工程材料有限公司；miR-152-3p mimics及mimics control購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；二甲基亞砜購自上海生工生物工程有限公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；SYBR premix Ex Taq試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自日本TaKaRa公司；MTT購自美國Sigma公司；VEGF抗體、IGF1抗體、GAPDH抗體及二抗購自美國Abcam公司。pGLO載體購自美國Pronema公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖情況，每2d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合達(dá)90%時(shí)，棄原細(xì)胞培養(yǎng)液，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且屬同一代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞接種于96孔板中，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，用不含血清培養(yǎng)基更換原培養(yǎng)基，饑餓處理12h使細(xì)胞同步化。將細(xì)胞隨機(jī)分為四組：(1)正常對(duì)照組：含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基；(2)高糖組：含30mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基；(3)高糖+miR-152-3p組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-152-3p mimics后以含30mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基干預(yù)；(4)高糖+NC組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics control后以含30mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基干預(yù)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，具體操作步驟參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。各組細(xì)胞置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況正常對(duì)照組、高糖組、高糖+miR-152-3p組和高糖+NC組細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為2×104個(gè)細(xì)胞，置37℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72h，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)在每孔細(xì)胞中添加MTT溶液(濃度為5mg/mL)10μL，37℃孵育4h，吸去上清液后再在每孔細(xì)胞中添加二甲基亞砜100μL，于震蕩儀上振蕩10min，至沉淀完全溶解，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490nm處讀取吸光度值(A值)，計(jì)算各組ARPE-19細(xì)胞增殖活性。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常對(duì)照組、高糖組、高糖+miR-152-3p組和高糖+NC組細(xì)胞培養(yǎng)48h后，用胰蛋白酶消化貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，離心收集細(xì)胞至1.5mL EP管中，用凋亡孵育緩沖液沖洗并重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)，分別在細(xì)胞中添加Annexin Ⅴ-FITC 5μL，室溫避光反應(yīng)15min，再加入PI染液5μL，4℃避光孵育30min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5熒光定量PCR檢測(cè)以上各組ARPE-19細(xì)胞處理48h后以Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。采用SYBR premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃ 5min，95℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 20s，共40個(gè)循環(huán)。得出的Ct值采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參，計(jì)算miR-152-3p相對(duì)表達(dá)水平，所用引物如下：miR-152-3p上游:5’- ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAG -3’; 下游：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCA-3’。U6上游:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.6 Western blot檢測(cè)以上四組ARPE-19細(xì)胞處理48h后，分別收集各組細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，分別加入蛋白裂解液置冰上裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白。取等量蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，分離蛋白后將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉封閉液中反應(yīng)2h，常規(guī)加入一抗VEGF(1∶500稀釋)、IGF1(1∶800稀釋)、GAPDH(1∶500稀釋)，4℃過夜孵育。PBST洗膜3次，加入二抗(1∶3000稀釋)室溫孵育2h。PBST洗膜3次，以ECL化學(xué)發(fā)光，顯影、定影，成像系統(tǒng)拍照，以Image J圖像分析系統(tǒng)分析個(gè)條帶灰度值。GAPDH為參照，目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)采用生物信息學(xué)TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-152-3p與IGF1基因存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，擴(kuò)增與miR-152-3p結(jié)合的IGF1 3’-UTR序列并構(gòu)建到pGLO載體上，同時(shí)將進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)序列點(diǎn)突變的IGF1 3’-UTR序列并構(gòu)建到pGLO載體上，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將重組載體IGF1-WT-pGLO或IGF1-MUT- pGLO與miR-152-3p mimics共轉(zhuǎn)染于ARPE-19細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置共轉(zhuǎn)染mimics control為對(duì)照，培養(yǎng)48h后分別收集各組細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性，以二者比值表示相對(duì)熒光素酶活性。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

表1 各組ARPE-19細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞活性比較

注：aP<0.05vs正常對(duì)照組；cP<0.05vs高糖+NC組。

表2 各組ARPE-19細(xì)胞miR-152-3p、IGF1和VEGF表達(dá)水平比較

注：aP<0.05vs正常對(duì)照組；cP<0.05vs高糖+NC組。

2結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)各組ARPE-19細(xì)胞活性MTT法檢測(cè)顯示，處理24h時(shí)，與正常對(duì)照組比，高糖組ARPE-19細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞活性降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與高糖+NC組比，高糖+miR-152-3p組ARPE-19細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞活性升高，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。處理48、72h時(shí)，與正常對(duì)照組比，高糖組ARPE-19細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖+NC組比，高糖+miR-152-3p組ARPE-19細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組比，高糖+NC組相對(duì)細(xì)胞活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。提示高糖處理能夠抑制ARPE-19細(xì)胞活性，轉(zhuǎn)染miR-152-3p mimics能夠逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞活性抑制作用。

圖2 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中IGF1和VEGF蛋白水平。

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組ARPE-19細(xì)胞凋亡率各組細(xì)胞處理48h后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況(圖1)，正常對(duì)照組、高糖組、高糖+miR-152-3p組和高糖+NC組細(xì)胞凋亡率分別為(3.15±0.36)%、(12.59±1.16)%、(5.44±0.61)%、(13.14±1.18)%。與正常對(duì)照組比，高糖組ARPE-19細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖+NC組比，高糖+miR-152-3p組ARPE-19細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組比，高糖+NC組細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示高糖處理能夠誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染miR-152-3p mimics能夠回調(diào)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.3各組ARPE-19細(xì)胞中miR-152-3p、IGF1和VEGF表達(dá)水平RT-PCR和Western blot檢測(cè)處理48h各組細(xì)胞中miR-152-3p、IGF1和VEGF表達(dá)水平，見圖2，表2。與正常對(duì)照組比，高糖組miR-152-3p表達(dá)水平明顯降低，IGF1和VEGF蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖+NC組比，高糖+miR-152-3p組miR-152-3p表達(dá)水平明顯升高，IGF1和VEGF蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組比，高糖+NC組細(xì)胞中miR-152-3p、IGF1和VEGF表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示高糖處理能夠下調(diào)ARPE-19細(xì)胞中miR-152-3p的表達(dá)，上調(diào)IGF1和VEGF的表達(dá)；轉(zhuǎn)染miR-152-3p mimics能夠上調(diào)miR-152-3p的表達(dá)，且可抑制IGF1和VEGF的表達(dá)。

圖3 miR-152-3p與IGF1 3’-UTR靶向結(jié)合位點(diǎn)示意圖。

表3 miR-152-3p靶向IGF1 3’-UTR相對(duì)熒光素酶活性比較

注：aP<0.05vsmimics control組。

2.4雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-152-3p靶向調(diào)控IGF1通過生物信息學(xué)軟件TargetScan分析結(jié)果顯示，IGF1是miR-152-3p的靶基因，二者靶向結(jié)合位點(diǎn)見圖3。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，IGF1-WT-pGLO共轉(zhuǎn)染中與mimics control組比，miR-152-3p mimics組相對(duì)熒光素酶活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.775，P<0.05)；IGF1-MUT-pGLO共轉(zhuǎn)染中與mimics control組比，miR-152-3p mimics組相對(duì)熒光素酶活性無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。提示IGF1是miR-152-3p的靶基因。

3討論

ARPE-19細(xì)胞是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中最常用于體外研究的細(xì)胞之一，本研究以ARPE-19細(xì)胞為基礎(chǔ)，探究糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)機(jī)制。糖尿病視網(wǎng)膜病變的特征在于毛細(xì)血管周細(xì)胞的早期脫落和由此導(dǎo)致的血管生成[14]。IGF1通常由肝細(xì)胞合成和分泌，并通過與特異性受體IGF1R的結(jié)合發(fā)揮作用，在結(jié)構(gòu)上，IGF1與前胰島素高度同源。有證據(jù)表明IGF1基因參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展[15]。與此一致，本研究表明，與正常對(duì)照組ARPE-19細(xì)胞相比，高糖能夠誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞中IGF1的高表達(dá)。最近，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)微小RNA參與糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生和進(jìn)展[16]。目前報(bào)道[17]顯示幾種miRNA在高血糖條件下差異表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，高糖降低了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19中miR-152-3p的表達(dá)。提示IGF1與miR-152-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。在本研究中，預(yù)測(cè)miR-152-3p是靶向IGF1的miRNA，因此推測(cè)miR-152-3p靶向IGF1可能參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制。在多種類型的癌細(xì)胞中miR-152-3p的表達(dá)降低，有研究顯示miR-152-3p通過靶向TMM 97在前列腺癌中扮演抑癌因子的作用[18]，還可調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和侵襲調(diào)控[19]。據(jù)報(bào)道，血漿hsa-miR-152-3p水平與2型糖尿病患者的糖尿病腎病有關(guān)[20]。因此本研究前期使用生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測(cè)IGF1和miR-152-3p之間存在靶向結(jié)合關(guān)系。為驗(yàn)證miR-152-3p和IGF1之間的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了IGF1-WT-pGLO和IGF1-MUT-pGLO熒光素酶載體。結(jié)果顯示，當(dāng)用IGF1-WT-pGLO熒光素酶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，miR-152-3p過表達(dá)抑制相對(duì)熒光素酶活性表達(dá)，但在IGF1-MUT-pGLO組中未被抑制。這些結(jié)果證明IGF1是miR-152-3p的靶基因。

VEGF是與血管生成、癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。胰島素上調(diào)VEGF表達(dá)，這種作用是由胰島素受體介導(dǎo)的[21]。胰島素對(duì)VEGF表達(dá)的上調(diào)已被認(rèn)為是糖尿病視網(wǎng)膜病變惡化的潛在解釋[22]。VEGF的過表達(dá)是糖尿病視網(wǎng)膜微血管病理性增生的重要原因之一。高糖誘導(dǎo)能夠?qū)е耉EGF的分泌增加[23]，與本研究一致。本研究通過高糖誘導(dǎo)，可促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞中VEGF表達(dá)。此外本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)高糖孵育48h后ARPE-19細(xì)胞活性顯著降低，凋亡率升高。因此，高糖誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)的增加，被認(rèn)為是ARPE-19細(xì)胞活性降低、凋亡增加的可能原因。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-152-3p對(duì)VEGF表達(dá)的抑制作用以及ARPE-19細(xì)胞活力和凋亡是通過靶向IGF1實(shí)現(xiàn)的，本實(shí)驗(yàn)用miR-152-3p的模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行IGF1和VEGF表達(dá)的干擾。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-152-3p mimics抑制了ARPE-19細(xì)胞中IGF1和VEGF的表達(dá)，上調(diào)miR-152-3p的表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)高糖處理的細(xì)胞活力的降低及凋亡的增加。

總之，本研究的結(jié)果表明，miR-152-3p的過表達(dá)抑制了IGF1的表達(dá)，導(dǎo)致VEGF途徑蛋白的下調(diào)，回調(diào)了ARPE-19細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步闡明了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制，miR-152-3p可能成為糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在治療靶點(diǎn)。