乙基多殺菌素及其代謝物在楊梅中的殘留及消解動態(tài)

吳淑春，梁赤周，虞 淼，徐 永，韓劍眾

(1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018；2.杭州醫(yī)學院，浙江 杭州 310053；3.浙江省農(nóng)藥檢定管理總站，浙江 杭州 310020)

乙基多殺菌素(spinetoram)是由美國陶氏益農(nóng)公司開發(fā)的一種新型多殺菌素類殺菌劑[1]，有效成分為乙基多殺菌素-J(代號為XDE-175-J)和乙基多殺菌素-L(代號為XDE-175-L)的混合物(結(jié)構(gòu)圖1)，乙基多殺菌素-J約占75.5%，乙基多殺菌素-J(22.5℃)外觀為白色粉末，乙基多殺菌素-L(22.9℃)外觀為白色至黃色晶體，帶苦杏仁味，在pH 5～7緩沖溶液中乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L都是穩(wěn)定的。乙基多殺菌素主要作用于昆蟲神經(jīng)中煙堿型乙酰膽堿受體和γ-氨基丁酸受體，致使蟲體對興奮性或抑制性的信號傳遞反應不敏感直至死亡[2]。乙基多殺菌素具有胃毒和觸殺作用，主要用于防治鱗翅目幼蟲、薊馬和潛葉蠅等，對小菜蛾、甜菜夜蛾、潛葉蠅、薊馬、斜紋夜蛾、豆莢螟等有好的防治效果。目前乙基多殺菌素懸浮劑、水分散粒劑已在我國水稻、甘藍、茄子、黃瓜、豇豆、西瓜、楊梅和芒果上已獲準登記使用，并已制定了稻谷、糙米、結(jié)球甘藍、茄子、豇豆上的臨時最大殘留限量[3]。

農(nóng)藥殘留聯(lián)席會議(JMPR)報告研究指出[4]，乙基多殺菌素在植物源樣品中的主要代謝物為N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J(結(jié)構(gòu)圖1)，對乙基多殺菌素進行膳食風險評估，需要乙基多殺菌素-J、乙基多殺菌素-L、N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J的殘留量。

目前已報道的關(guān)于乙基多殺菌素在環(huán)境中殘留分析方法主要有液相色譜法(LC)[5-8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9-10]，這些分析方法均只檢測了乙基多殺菌素母體，傅強等[11]用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對水稻樣品中乙基多殺菌素及其代謝物的殘留量進行了研究。王天玉等[12]研究了高效液相色譜法檢測楊梅中乙基多殺菌素母體的方法。本研究采用LC-MS/MS分析方法，同時檢測楊梅樣品中乙基多殺菌素及其代謝物的殘留量和降解規(guī)律，旨在為乙基多殺菌素在楊中的膳食風險評估、制定農(nóng)藥殘留限量標準提供分析方法，也為進一步探究乙基多殺菌素及其代謝物對非靶標生物的毒性效應和農(nóng)藥的合理安全使用提供參考依據(jù)。為此，我們在浙江省臺州市、浙江省寧波市、福建省建陽市、福建省建甌市開展了60g/L乙基多殺菌素懸浮劑在楊梅上的殘留田間試驗。

圖1 乙基多殺菌素及其主要代謝物結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 藥劑及試劑 標準品96.7%的乙基多殺菌素(其中乙基多殺菌素-J 76.7%，乙基多殺菌素-L 20%)、98%的N-Formyl-175-J和99%的N-Demethyl-175-J，乙腈(HPLC級),甲醇(HPLC級)，氯化鈉(AR級)，二氯甲烷(AR級)，乙酸銨(色譜純)，乙酸(分析純)，Strata NH2柱(500mg/6mL)，微孔有機濾膜(0.22 μm)。

1.1.2 儀器設(shè)備 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS-MS)(Waters Xevo TQ)，氮吹儀(N-EVAP 112)，電子天平(PL202-L Ⅲ)，超純水凈化系統(tǒng)(Milli-Q)，漩渦混合器(IKA)，調(diào)速多用振蕩器(HY-2)，電熱恒溫水浴鍋。

1.2 田間試驗設(shè)計 按農(nóng)藥殘留試驗準則要求設(shè)試驗小區(qū)，3株楊梅樹為1個試驗小區(qū)，每個處理3個小區(qū)重復，小區(qū)間設(shè)保護行，同時設(shè)不施藥小區(qū)對照。60g/L乙基多殺菌素懸浮劑防治楊梅果蠅，企業(yè)推薦使用藥量為有效成分40mg/kg，噴霧施藥1次。

1.2.1 消解動態(tài)試驗 楊梅成熟一半大小時，按有效成分60mg/kg的劑量均勻噴霧施藥1次，施藥后2h,1、2、3、5、7、10、14、21d，按照殘留試驗準則果樹樣品采樣要求，在試驗小區(qū)內(nèi)采摘生長正常、無病害的楊梅果實，每小區(qū)采摘量≥2kg。

1.2.2 最終殘留試驗 楊梅成熟前半個月左右，按有效成分40和60mg/kg施藥劑量，各施藥1次和2次，施藥間隔7d。末次施藥后1、2、3、5、7d，按照殘留試驗準則果樹樣品采樣要求，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機采摘生長正常、無病害的楊梅果實，每小區(qū)≥2kg。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理 田間樣品處理：田間樣品采集后，8h內(nèi)運回實驗室。楊梅去核后用食物調(diào)理機打成均勻漿狀，150g樣品2份，分別裝入封口樣品容器中，-20℃凍存。

提取與凈化：稱取處理好的楊梅試樣25.0g(精確至0.01g)于250mL燒杯中，加入50.0mL乙腈，高速勻漿2min，用濾紙過濾至裝有5～7g氯化鈉的100mL具塞量筒中，塞緊后劇烈震蕩1min，在室溫下靜置30min，使水相和乙腈相分層，從具塞量筒中吸取上層有機相10.0mL于50mL燒杯中，置于80℃水浴鍋上，氮吹至近干，加入2.0mL甲醇:二氯甲烷(1∶9，V/V)溶劑，充分溶解，待凈化。將氨基柱用4.0mL甲醇+二氯甲烷(V∶V=10∶90)預洗，當液面到達柱吸附層表面時，加入上述待凈化溶液凈化，洗脫液用15mL離心管收集，洗燒杯用4.0mL甲醇+二氯甲烷(V∶V=10∶90)洗滌2次并過柱。然后將離心管置于氮吹儀，水浴溫度為50℃，氮吹蒸發(fā)至近干，甲醇定容至5mL，在混合器上混均后，用0.22μm濾膜過濾，LC-MS-MS測定。

1.3.2 液相色譜條件 色譜柱：Phenomenex XB-C18(100mm×2.1mm×2.6μm)；流動相：甲醇(A)和5mmol乙酸銨-0.1%乙酸緩沖溶液(B)；流動相速度：0.2mL/min；柱溫：35℃；進樣體積：5μL。液相梯度洗脫程序(表1)。

表1 液相梯度洗脫程序

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；離子源溫度：150℃；電離方式：ES+；監(jiān)測方式：MRM；毛細管電壓：3.0kV；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣流速：800L/h；錐孔反吹氣流速：40L/h；碰撞氣流速：0.15mL/min；定量方式：外標法。質(zhì)譜條件(表2)。

表2 乙基多殺菌素測定的ES-MS-MS條件

*定量離子

1.3.4 標準曲線 將乙基多殺菌素及其代謝物分別溶解于甲醇，配制成500mg/L的母液，再分別移取1mL各母液至50mL容量瓶，甲醇定容，配成10mg/L的混合標準溶液，然后用甲醇稀釋成0.02、0.1、0.2、1.0、2.0μg/L的系列混合標準工作溶液，按1.3的儀器條件測定。以進樣質(zhì)量濃度(x)為橫坐標、響應值(y)為縱坐標繪制標準工作曲線，外標法定量。

1.3.5 添加回收 向空白楊梅樣品中分別添加0.05、0.5、1.0mg/kg的乙基多殺菌素及其代謝物混合標準工作溶液(在此添加水平下，乙基多殺菌素-J的添加濃度相當于0.04、0.4、0.8mg/kg，乙基多殺菌素-L的添加濃度相當于0.01、0.1、0.2mg/kg)，采用所建立的方法測定其添加回收率及相對標準偏差。每個添加水平重復5次，同時設(shè)空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍 在0.02～2.0μg/L范圍內(nèi)，以監(jiān)測離子峰面積(y)為縱坐標，進樣濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線，乙基多殺菌素及其代謝物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.993 3～1.0之間(表3)。

表3 乙基多殺菌素及其代謝物的標準曲線方程

2.2 回收率和精密度 乙基多殺菌素及其代謝物在楊梅樣品中的添加回收試驗結(jié)果(表4)，當乙基多殺菌素-J 添加濃度為0.04、0.4和0.8mg/kg，乙基多殺菌素-L 的添加濃度為0.01、0.1、0.2mg/kg，代謝物的添加水平為0.05、0.5、1.0mg/kg，平均回收率在82.6%～96.6%之間，相對標準偏差為3.3%～7.4%之間，方法的精密度和準確度均較好，符合農(nóng)藥殘留分析的要求[13]。乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L在楊梅樣品中的定量限分別為0.04mg/kg和0.01mg/kg，代謝物N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J的定量限為0.05mg/kg。楊梅添加回收試驗典型譜圖(圖2～圖4)。

表4 乙基多殺菌素及其代謝物在楊梅中添加回收率及相對標準偏差

圖2 乙基多殺菌素及其代謝物標準溶液(0.1mg/L)的MRM質(zhì)譜圖

圖3 楊梅空白樣品的MRM質(zhì)譜圖

圖4 楊梅添加樣品(0.05mg/kg)的MRM質(zhì)譜圖

2.3 消解動態(tài)試驗 60g/L乙基多殺菌素懸浮劑以有效成分60mg/kg劑量噴霧施藥，浙江臺州、浙江寧波、福建建陽、福建建甌4試驗地楊梅中的乙基多殺菌素的降解符合一級反應動力學方程，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.929 8～0.976 5之間，半衰期為0.9～2.6d，降解速度較快。乙基多殺菌素在楊梅中的消解動力學參數(shù)(表5)。

表5 乙基多殺菌素在楊梅中的消解動力學參數(shù)

2.4 最終殘留試驗 最終殘留試驗結(jié)果表明，60g/L乙基多殺菌素懸浮劑分別按照40和60mg/kg的劑量，施藥1次和2次，施藥后1、2、3、5、7d，楊梅中乙基多殺菌素(乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L之和)最終殘留量分別為<0.05～0.38、<0.05～0.39、<0.05～0.32、<0.05～0.19、<0.05～0.11mg/kg，乙基多殺菌素在楊梅中的最終殘留規(guī)律明顯，殘留量隨著采收間隔期的延長而降低。代謝物N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J的殘留量均<0.05mg/kg。乙基多殺菌素在楊梅中殘留量詳細數(shù)據(jù)(表6)。

表6 乙基多殺菌素在楊梅中的殘留量

3 結(jié)論與討論

3.1 果蠅是對楊梅生產(chǎn)影響最大的蟲害之一，尤其是楊梅上市前期。乙基多殺菌素對果蠅的防治有很好的效果[14]，從本試驗結(jié)果看，乙基多殺菌素在楊梅中的平均消解半衰期只有0.9～2.6d，降解速度非常快，這對保證消費者安全非常有利。

3.2 目前我國、CAC及其他國家都未規(guī)定乙基多殺菌素在楊梅上的最大殘留限量。GB 2763-2018.1中規(guī)定了乙基多殺菌素在相關(guān)水果上的臨時最大殘留限量分別為：橙子0.07mg/kg,仁果類水果0.05mg/kg,桃和油桃0.3mg/kg,藍莓0.2mg/kg,覆盆子0.8mg/kg,葡萄0.3mg/kg。根據(jù)試驗結(jié)果，用藥量40～60mg/kg，施藥1～2次，末次施藥后7d，乙基多殺菌素在楊梅中的最終殘留量為<0.05～0.11mg/kg。建議我國乙基多殺菌素在楊梅上的最大殘留限量值為0.5mg/kg。

3.3 建議使用60g/L乙基多殺菌素懸浮劑防治楊梅果蠅，有效成分用藥量40mg/kg，施藥1次，安全間隔期7d。