跑臺運動通過激活A(yù)MPK減少APP/PS1小鼠海馬Aβ沉積

閆清偉，趙 娜，夏 杰，李百俠，崔海燕

單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphateactivated protein kinase，AMPK）是能量代謝的開關(guān)，對維持機體能量代謝穩(wěn)態(tài)有重要調(diào)節(jié)作用。研究證實，大腦能量代謝減退與阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）病理進程密切相關(guān)，能源物質(zhì)ATP可抑制β-淀粉樣蛋白（beta-Amyloid，Aβ）的高分子聚集，減弱其神經(jīng)毒性，降低腦內(nèi)老年性斑塊（Senile plaques，SPs）的形成，繼而發(fā)揮抗AD效應(yīng)；而ATP合成不足，則可加速AD病理（Coskuner et al.，2014；Jung et al.，2012；Muller et al.，2017）。β-位淀粉樣前體蛋白裂解酶1（beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）是Aβ生成的一種關(guān)鍵裂解酶，另外，能量代謝相關(guān)因子，如AMPK、去乙?；?（Sirtuin1，Sirt1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor gamma，PPARγ）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha，PGC1α）等可調(diào)節(jié)BACE1表達。有研究認為，AMPK-BACE1（即AMPK-Sirt1-PPARγ-PGC1α-BACE1）通路可調(diào)節(jié)Aβ生成，大腦能量代謝減退可通過下調(diào)AMPK活性及后續(xù)相關(guān)因子表達，產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，最終上調(diào)BACE1的腦內(nèi)表達（Wang et al.，2013），繼而增加腦內(nèi)Aβ沉積，這可能是大腦能量代謝減退造成腦內(nèi)SPs增多、認知功能減退的重要病理機制。

合理的運動對AD病理有積極的改善作用。2013年9月，華盛頓召開了國際大腦與營養(yǎng)學(xué)會議，會議上有學(xué)者指出，保持運動和健康生活方式是防治AD發(fā)病的有效措施（Barnard et al.，2014）。另有研究通過對MEDLINE，CINAHL，Web of Science，and Scopus等數(shù)據(jù)庫文獻研究發(fā)現(xiàn)，運動可提高AD患者的持續(xù)注意力、視覺記憶及前額葉認知功能（Hernandez et al.，2015）。對人體進行的實驗研究也證實，3個月的有氧運動可以改善輕度AD患者的認知功能（Yang et al.，2015）。近年來有動物實驗研究證實，運動可抑制Aβ生成，改善AD認知功能（余鋒 等，2016；Koo et al.，2017；Moore et al.，2016；Zhang et al.，2017）。然而，關(guān)于運動改善AD病理，抑制Aβ沉積的分子機制，目前仍未探明。體育科學(xué)領(lǐng)域的研究證實，適當(dāng)?shù)倪\動可提高骨骼肌AMPK活性，上調(diào)Sirt1蛋白表達，影響AMPK/PGC1α信號（許杰 等，2018；Hoffman et al.，2015；Liao et al.，2017；Niederberger et al.，2015），但關(guān)于運動是否可提高腦內(nèi)AMPK活性，影響AMPK-BACE1通路信號，繼而影響Aβ生成與沉積的系統(tǒng)研究，目前鮮見報道。

APP/PS1小鼠是AD研究領(lǐng)域中一種經(jīng)典的轉(zhuǎn)基因動物模型，該模型小鼠體內(nèi)被轉(zhuǎn)入人類突變的APPSwe和PS1（PSEN1dE9）2個AD致病基因，導(dǎo)致APP/PS1小鼠自3月齡開始，腦內(nèi)Aβ沉積逐漸增多，至5～6月齡時，腦內(nèi)Aβ沉積更加顯著，此時可檢測出明顯SPs，同時小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降（Collins et al.，2015；Guo et al.，2015；Mei et al.，2016；Sorrentino et al.，2017）。為探討運動降低Aβ的分子機制，本研究采用APP/PS1小鼠為研究對象，對小鼠海馬AMPK-BACE1通路及其相關(guān)因素進行系統(tǒng)檢測與研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

本實驗所用APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩野生型（wide type，WT）小鼠均購自南京模式動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（2015-0001），飼養(yǎng)環(huán)境溫度：23℃～26℃，濕度50%～65%，12 h光照/12 h黑暗，SPF級轉(zhuǎn)基因動物標(biāo)準飼料，所有小鼠均自由飲食。

將3月齡APP/PS1小鼠48只及WT小鼠48只分別隨機分組，即APP/PS1型小鼠分為APP/PS1安靜對照組（ADC組，n=24）和APP/PS1運動組（ADE組，n=24），WT小鼠分為野生安靜對照組（WTC組，n=24）和野生運動組（WTE組，n=24）。

1.2 運動方案

自3月齡開始，對ADE組、WTE組小鼠進行12周跑臺運動。運動方案參考Baker等（1999）的研究，并做適當(dāng)調(diào)整。本實驗采用45%～55%最大攝氧量（45%～55%O2max）的中等強度有氧運動，通過文獻分析及適應(yīng)性訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)，該運動方案在各組小鼠的可承受范圍內(nèi)，各組小鼠均能完成本運動訓(xùn)練。具體方案由1周運動適應(yīng)和12周正式運動組成。

1周運動適應(yīng)：第1～2天速度5 m/min，第3～4天速度8 m/min，第5～6天速度12 m/min。第1天運動時間20 min，之后每天延長5 min，至第6天運動時間延長至45 min。每天運動時間固定在18：00-20：00。周日休息。

12周正式運動：適應(yīng)性運動1周后進行12周正式運動，每周一、二、三、五、六的18：00-20：00運動，周四、六休息。每天運動方案：5 m/min×5 min，8 m/min×5 min，12 m/min×30 min，最后以5 m/min×5 min后結(jié)束，總運動時間為45 min。同時，為避免跑臺環(huán)境刺激的干擾，減少各組小鼠運動之外的刺激差異，每天將WTC組和ADC組小鼠置于安靜跑臺相同時間。

1.3 取材

12周正式運動結(jié)束后，小鼠禁食12 h，取各組小鼠18只，異氟烷吸入法麻醉后脫頸處死，取海馬組織，置液氮降溫后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待測。各組余6只小鼠，腹腔注射10%的水合乙醛（3.5 ml/kg）麻醉后，進行心臟灌注法固定，先用0.9%的生理鹽水灌注，待肝臟變白后改用4%多聚甲醛灌注固定，至小鼠身體僵直變硬后取全腦，并將全腦置入4%多聚甲醛浸泡固定24 h后，進行脫水、石蠟包埋。

1.4 ELISA實驗

取小鼠海馬組織20 mg，按質(zhì)量/體積比mg：μl=1：9加入預(yù)冷的1×PBS，制備海馬組織勻漿，采用AMP、ATP試劑盒（上海酶聯(lián)，ml6037251，ml9037510）進行ELISA實驗，測定海馬AMP、ATP濃度，計算AMP/ATP比值。ELISA實驗基本步驟包括：試劑的室溫平衡、劃分板區(qū)與上樣、抗體孵育、洗滌、底物反應(yīng)、終止及檢測、計算濃度等。

1.5 RT-qPCR實驗

取海馬組織20 mg，采用Trizol法加相應(yīng)試劑提取海馬總RNA。按照TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FSQ-101）說明書進行反轉(zhuǎn)錄，制備海馬cDNA。采用SYBR Green法進行RT-qPCR實驗，根據(jù)所測目的基因和內(nèi)參基因CT值，計算ΔCT值，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達水平?；蛞锶绫?所示。

表1 基因引物序列Table 1 Gene Primers Sequence

1.6 Western Blot實驗

取海馬組織20 mg，按mg：μl=1：7比例加入相應(yīng)體積RIPA裂解液，提取海馬總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后配平，蛋白變性后，進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、洗滌、蛋白印跡成像，用Alpha Ease FC軟件進行數(shù)據(jù)采集?？贵w信息如表2所示。

表2 抗體信息Table 2 Antibody Information

1.7 免疫組織化學(xué)實驗

取制備好的蠟塊進行制片、脫蠟、抗原修復(fù)、內(nèi)源過氧化物酶的阻斷、封閉、抗體孵育（Aβ，ab2539，1：100；羊抗兔，Jackson Immuno Research，1：1 000）、DAB顯色、細胞核染色、脫水封片、拍照。采用Image-Pro Plus 6.0軟件，計算腦內(nèi)單位面積SPs水平，本實驗采用圖像視野內(nèi)SPs的積分光密度值（IOD sum）除以視野區(qū)域面積（area sum，即視野內(nèi)的全部像素數(shù)量總和）反映單位面積內(nèi)SPs水平。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與作圖采用Graphpad Prism 7.0軟件，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準差（M±SD）表示，統(tǒng)計方法采用雙因素方差分析（two-way ANOVA），事后檢驗采用Bonferroni法，以P＜0.05代表差異具有顯著性，P＜0.01代表差異具有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 小鼠海馬AMP、ATP濃度及其比值結(jié)果

2.1.1 小鼠海馬AMP濃度結(jié)果

基因和運動對AMP影響的主效應(yīng)均不顯著［F（1，20）=7.2342.707，P=0.115 5；F（1，20）=2.396，P=0.137 3］，交互作用顯著［F（1，20）=7.147，P=0.014 6］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ADC組小鼠海馬AMP較WTC組顯著降低（P＜0.05），ADE組小鼠海馬AMP較ADC組顯著升高（P＜0.05，圖1）。

2.1.2 小鼠海馬ATP濃度結(jié)果

基因?qū)TP影響的主效應(yīng)不顯著［F（1，20）=2.396，P=0.137 3］，運動對ATP影響的主效應(yīng)顯著［F（1，20）=10.17，P=0.004 6］。二者對ATP的交互作用顯著［F（1，20）=26.41，P＜0.000 1］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ADC組小鼠海馬ATP較WTC組顯著降低（P＜0.01），ADE組小鼠海馬ATP較ADC組顯著升高（P＜0.01，圖1）。

2.1.3 小鼠海馬AMP/ATP比值結(jié)果

基因和運動對AMP/ATP比值影響的主效應(yīng)顯著［F（1，20）=25.78，P＜0.000 1；F（1，20）=9.954，P=0.005］，二者對AMP/ATP的交互作用不顯著［F（1，20）=2.221，P=0.151 8］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ADC組小鼠海馬AMP/ATP比值較WTC組顯著降低（P＜0.01），ADE組小鼠海馬AMP/ATP較ADC組顯著升高（P＜0.05，圖1）。

圖1 各組小鼠海馬ATP、AMP及AMP/ATP水平（n=6）Figure 1. Levels of ATP，AMP and AMP/ATP in the Mice Hippocampus of Each Group

2.2 小鼠海馬AMPK表達結(jié)果

2.2.1 小鼠海馬AMPK mRNA表達結(jié)果

基因和運動均對AMPK mRNA影響的主效應(yīng)顯著［F（1，20）=15.82，P=0.000 7；F（1，20）=10.33，P=0.004 3］。二者對AMPK mRNA的交互作用不顯著［F（1，20）=1.26，P=0.274 9］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ADC組小鼠海馬AMPK mRNA較WTC組顯著降低（P＜0.05），ADE組小鼠海馬AMPK mRNA較ADC組顯著升高（P＜0.05，圖2）。

圖2 各組小鼠海馬AMPK表達結(jié)果（n=6）Figure 2. Expression of AMPK in Mice Hippocampus

2.2.2 小鼠海馬AMPK蛋白表達結(jié)果

基因和運動均對AMPK 蛋白質(zhì)影響的主效應(yīng)顯著［F（1，20）=6.631，P=0.018 1；F（1，20）=18.61，P=0.000 3］。二者對小鼠海馬AMPK蛋白的交互作用不顯著［F（1，20）=0.018 53，P=0.893 1］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與WTC組相比，ADC組小鼠AMPK蛋白表達有所降低，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而WTE組AMPK蛋白較WTC組顯著升高（P＜0.05），ADE組AMPK蛋白較ADC組顯著升高（P＜0.05，圖2）。

2.2.3 小鼠海馬磷酸化AMPK蛋白表達結(jié)果

基因和運動均對磷酸化AMPK（phosphorylation AMPK，p-AMPK）影響的主效應(yīng)顯著［F（1，20）=7.517，P=0.012 6；F（1，20）=9.585，P=0.005 7］。二者對p-AMPK的交互作用不顯著［F（1，20）=2.583，P=0.123 7］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ADC組小鼠海馬p-AMPK蛋白較WTC組顯著降低（P＜0.05），ADE組小鼠海馬p-AMPK較ADC組顯著升高（P＜0.05，圖2）。

2.3 小鼠海馬Sirt1、PPARγ、PGC1α蛋白表達結(jié)果

2.3.1 小鼠海馬Sirt1蛋白表達結(jié)果

基因和運動均對Sirt1 蛋白影響的主效應(yīng)顯著［F（1，20）=15.96，P=0.000 7；F（1，20）=10.22，P=0.004 5］。二者對Sirt1蛋白的交互作用不顯著［F（1，20）=1.644，P=0.214 4］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ADC組小鼠海馬Sirt1蛋白較WTC組顯著降低（P＜0.01），ADE組小鼠海馬Sirt1蛋白較ADC組顯著升高（P＜0.05，圖3）。

2.3.2 小鼠海馬PPARγ蛋白表達結(jié)果

基因和運動均對PPARγ蛋白影響的主效應(yīng)顯著［F（1，20）=15.16，P=0.000 9；F（1，20）=7.195，P=0.014 3］。二者對PPARγ蛋白的交互作用不顯著［F（1，20）=2.509，P=0.128 9］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ADC組小鼠海馬PPARγ蛋白較WTC組顯著降低（P＜0.01），ADE組小鼠海馬PPARγ蛋白較ADC組顯著升高（P＜0.05，圖3）。

2.3.3 小鼠海馬PGC1α蛋白表達結(jié)果

基因和運動均對PGC1α蛋白的主效應(yīng)顯著［F（1，20）=11.44，P=0.003 0；F（1，20）=9.747，P=0.005 4］。二者對PGC1α蛋白的交互作用不顯著［F（1，20）=2.84，P=0.107 5］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ADC組小鼠海馬PGC1α蛋白較WTC組顯著降低（P＜0.05），ADE組小鼠海馬PGC1α蛋白較ADC組顯著升高（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠海馬Sirt1、PPARγ、PGC1α蛋白表達結(jié)果（n=6）Figure 3. Protein Expression of Sirt1、PPARγ、PGC1α in Mice Hippocampus

2.4 小鼠海馬BACE1表達結(jié)果

2.4.1 小鼠海馬BACE1 mRNA表達結(jié)果

基因?qū)ACE1 mRNA影響的主效應(yīng)顯著［F（1，20）=14.5，P=0.001 1］，運動對BACE1 mRNA的主效應(yīng)不顯著［F（1，20）=3.634，P=0.071 1］。二者對BACE1 mRNA的交互作用顯著［F（1，20）=5.535，P=0.029 0］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ADC組小鼠海馬BACE1 mRNA較WTC組顯著升高（P＜0.01），ADE組小鼠海馬BACE1 mRNA較ADC組顯著降低（P＜0.05，圖4）。

圖4 各組小鼠海馬BACE1的mRNA和蛋白表達結(jié)果（n=6）Figure 4. mRNA and Protein Expression of BACE1in Mice Hippocampus

2.4.2 小鼠海馬BACE1蛋白表達結(jié)果

基因?qū)ACE1蛋白影響的主效應(yīng)顯著［F（1，20）=11.87，P=0.002 6］，運動對BACE1蛋白的主效應(yīng)不顯著［F（1，20）=1.752，P=0.200 5］。二者對BACE1蛋白的交互作用顯著［F（1，20）=8.243，P=0.009 4］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ADC組小鼠海馬BACE1蛋白較WTC組顯著升高（P＜0.01），ADE組小鼠海馬BACE1蛋白較ADC組顯著降低（P＜0.05，圖4）。

2.5 小鼠海馬Aβ蛋白及SPs結(jié)果

2.5.1 小鼠海馬Aβ蛋白結(jié)果

基因和運動對Aβ蛋白影響的主效應(yīng)顯著［F（1，20）=62.17，P＜0.000 1；F（1，20）=23.05，P=0.000 1］。二者對Aβ蛋白影響的交互作用不顯著［F（1，20）=3.311，P=0.083 8］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ADC組小鼠海馬Aβ蛋白較WTC組極顯著性升高（P＜0.01），ADE組小鼠海馬Aβ蛋白較ADC組極顯著性降低（P＜0.01，圖5）。

2.5.2 小鼠海馬SPs結(jié)果

基因和運動對SPs影響的主效應(yīng)顯著［F（1，20）=140.5，P＜0.000 1；F（1，20）=18.46，P=0.000 4］。二者對SPs的交互作用不顯著［F（1，20）=2.618，P=0.121 3］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ADC組小鼠海馬SPs較WTC組顯著升高（P＜0.01），ADE組小鼠海馬SPs較ADC組顯著降低（P＜0.01，圖6）。

圖5 各組小鼠海馬Aβ蛋白水平（n=6）Figure 5. Aβ Protein Level in Mice Hippocampus of Each Group

圖6 各組小鼠海馬Aβ蛋白和SPs水平（n=6）Figure 6. SPs Level in Mice Hippocampus of Each Group

3 討論

3.1 運動對小鼠AMPK-BACE1通路的影響

海馬能量代謝減退可能導(dǎo)致和加劇AD病理。研究證實，能量代謝不足可上調(diào)Aβ的產(chǎn)生和沉積，其分子機制與AMPK-BACE1通路有關(guān)（Wang et al.，2013），該通路包括AMPK、Sirt1、PPARγ、PGC1α、BACE1等幾個關(guān)鍵基因。本研究證實，12周跑臺運動可降低6月齡APP/PS1小鼠海馬Aβ，而運動對Aβ的這一抑制效應(yīng)是否與上述通路有關(guān)，目前尚不清楚。因此，為探討運動下調(diào)BACE1基因表達，減少Aβ的分子機制，本實驗對AMPK-BACE1通路關(guān)鍵基因及相關(guān)因素進行了系統(tǒng)研究。

3.1.1 運動對小鼠海馬AMPK的影響

AMPK是機體能量代謝的開關(guān)，對細胞能量代謝穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用。AMPK活性受AMP/ATP調(diào)節(jié)，即AMP/ATP比值增高，AMPK活性增強，比值下降，AMPK活性降低（Ke et al.，2018）。p-AMPK是AMPK的活性形式，其表達水平反映了AMPK活性水平。

AMPK活性降低可加劇AD病理。對6月齡APP/PS1小鼠的研究證實，大腦海馬p-AMPK降低，Aβ增多（Ou et al.，2018）。7月齡APP/PS1小鼠海馬p-AMPK顯著低于野生對照組，二甲雙胍可上調(diào)APP/PS1小鼠海馬p-AMPK，下調(diào)BACE1，改善AD病理（Pedros et al.，2014）。上述研究提示，AMPK與AD病理密切相關(guān)，AMPK活性下降可能誘發(fā)AD病理。與上述研究一致，本研究證實，6月齡APP/PS1小鼠（ADC組）海馬AMPK mRNA和p-AMPK均顯著低于同月齡WTC組水平，提示其AMPK活性下降。盡管兩組間AMPK mRNA存在顯著差異，但兩組間AMPK蛋白水平差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），進一步分析認為，造成這一現(xiàn)象的原因可能與兩組小鼠AMPK蛋白的降解程度不同有關(guān)，并且，磷酸化形式的AMPK（p-AMPK）可能更容易降解，本研究結(jié)果顯示，WTC組小鼠海馬p-AMPK顯著高于ADC組，這可能是導(dǎo)致兩組AMPK蛋白差異不明顯的原因。本研究同時證實，APP/PS1小鼠海馬AMP、ATP濃度及AMP/ATP比值顯著低于WTC組，進一步佐證了APP/PS1小鼠海馬AMPK活性的下降。另外，本研究證實APP/PS1小鼠海馬ATP含量降低，提示，該模型小鼠腦能量代謝受阻，腦內(nèi)可能存在低能量代謝應(yīng)激。

研究證實，上調(diào)腦p-AMPK，可提高AMPK活性，繼而減少腦內(nèi)Aβ的生成（Vingtdeux et al.，2010；Zhu et al.，2013），這可能是AD治療的一個有效靶標(biāo)。對骨骼肌和腦組織的研究均證實，運動可上調(diào)AMPK活性（Ke et al.，2018；Kjobsted et al.，2017；Krishna et al.，2017）。本研究也證實，12周跑臺運動可上調(diào)APP/PS1小鼠海馬AMPK mRNA水平，同時上調(diào)AMPK和p-AMPK的蛋白表達水平，進一步佐證了運動可增強APP/PS1小鼠海馬AMPK活性。本研究同時證實，12周跑臺運動可增加APP/PS1小鼠海馬AMP、ATP含量，上調(diào)AMP/ATP比值，進一步證明了運動對海馬AMPK的激活效應(yīng)。綜上研究提示，6月齡APP/PS1小鼠海馬AMPK活性下降，ATP含量降低，腦內(nèi)存在相應(yīng)能量代謝應(yīng)激，12周跑臺運動可上調(diào)AMPK活性，改善海馬能量代謝。

3.1.2 運動對小鼠海馬Sirt1表達的影響

Sirt1是一種NAD依賴性去乙?；?，可調(diào)控基因的表觀遺傳學(xué)沉默，與能量代謝相關(guān)，上調(diào)Sirt1可增強胰島素敏感性（Liu et al.，2016）。另外，Sirt1與AD病理密切相關(guān)。研究證實，Sirt1可促進Aβ降解，抑制Aβ造成的神經(jīng)凋亡，Sirt1不足，認知功能下降（Chen et al.，2016；Cho et al.，2015；Kumar et al.，2017）。激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)Sirt1可延緩AD轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)退變進程，抑制Aβ生成（Hou et al.，2016；Marques et al.，2012）。研究證實，2、4、6月齡3xTg-AD小鼠海馬Sirt1水平持續(xù)下降，腦內(nèi)Aβ增多（Torres-lista et al.，2014）。上述研究提示，Sirt1可抑制腦內(nèi)Aβ生成，Sirt1表達不足可導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ增多，加速AD病理。本研究證實，與WTC組相比，ADC組小鼠海馬Sirt1蛋白表達降低，與上述研究結(jié)果一致，提示，Sirt1參與了APP/PS1小鼠病理進程。上調(diào)Sirt1表達，可能有助于改善AD病理。研究證實，6個月跑輪運動可上調(diào)3xTg-AD小鼠腦內(nèi)Sirt1表達，改善其認知功能（Revilla et al.，2014）。本研究證實，12周跑臺運動可上調(diào)APP/PS1小鼠海馬Sirt1蛋白表達，抑制腦內(nèi)Aβ，與上述研究結(jié)果一致。

3.1.3 運動對小鼠海馬PPARγ表達的影響

PPARγ可抑制AD病理。有研究發(fā)現(xiàn)，β-丁香烯可激活大麻素受體2和PPARγ通路，減少APP/PS1小鼠大腦Aβ沉積，改善認知功能（Cheng et al.，2014）。傳統(tǒng)中藥三七可激活PPARγ，減少6月齡APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ沉積，改善小鼠認知功能，而采用PPARγ拮抗劑GW9662則可阻斷這一效應(yīng)（Li et al.，2015）。對8月齡APP/PS1小鼠腹腔注射姜黃素4周，可激活PPARγ，抑制Aβ沉積，改善小鼠記憶能力，PPARγ拮抗劑GW9662同樣也可阻斷這一效應(yīng)（Liu et al.，2016）。綜上研究提示，PPARγ可通過抑制Aβ，改善AD病理，PPARγ表達及活性降低可能與大腦認知功能障礙有關(guān)。本研究證實，6月齡APP/PS1小鼠海馬PPARγ蛋白表達顯著低于WTC組，12周跑臺運動可上調(diào)海馬PPARγ表達，提示，PPARγ表達下調(diào)可能介導(dǎo)了6月齡APP/PS1小鼠海馬Aβ的大量沉積，而12周跑臺運動可抑制這一現(xiàn)象。

3.1.4 運動對小鼠海馬PGC1α表達的影響

PGC1α是線粒體生物發(fā)生的主要調(diào)節(jié)蛋白，是調(diào)節(jié)細胞能量代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄共激活因子（Dorn et al.，2015；Sanchis-gomar et al.，2014；Valero et al.，2014）。通過核受體PPARγ，PGC1α可與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯。近期研究證實，PGC1α可抑制Aβ生成（Xia et al.，2017）。AD患者大腦PGC1α表達下降，且伴有線粒體功能異常（Austin et al.，2012；Sweeney et al.，2016）。研究證實，自3月齡開始，APP/PS1小鼠海馬即表現(xiàn)出PGC1α蛋白表達下降（Ettcheto et al.，2016）。上述研究提示，PGC1α表達下調(diào)可能參與了AD病理進程。本研究證實，6月齡APP/PS1小鼠海馬PGC1α蛋白表達顯著降低，提示，PGC1α表達下調(diào)可能介導(dǎo)了該模型小鼠的病理進程，這可能和本實驗中6月齡小鼠所表現(xiàn)出的能量代謝減退有關(guān)。PGC1α蛋白表達受Sirt1調(diào)控，Sirt1可與PGC1α綁定結(jié)合，并通過去乙酰化作用激活PGC1α（Gurd，2011；Yu et al.，2018）。近年來的研究顯示，運動可上調(diào)PGC1α蛋白表達（Erlich et al.，2018）。本研究也證實，12周跑臺運動可顯著上調(diào)PGC1α蛋白質(zhì)表達水平，這可能和運動抑制APP/PS1小鼠海馬Aβ，改善AD病理有關(guān)。有研究顯示，AMPK可通過調(diào)節(jié)NAD+/NADH調(diào)控Sirt1表達，Sirt1還可影響PGC1α、PPARγ等能量代謝調(diào)控因子（Chen et al.，2016；Shin et al.，2014）。提示，12周跑臺運動上調(diào)PPARγ和PGC1α表達，改善APP/PS1小鼠病理的機制可能和激活A(yù)MPK，進而上調(diào)Sirt1表達有關(guān)。

3.1.5 運動對小鼠海馬BACE1及海馬區(qū)Aβ沉積的影響

BACE1是AD病理中重要的β-裂解酶。Aβ學(xué)說認為，正常情況下，APP經(jīng)α-裂解酶裂解生成C83片段，C83再經(jīng)γ-裂解，此過程不產(chǎn)生Aβ，而在衰老和AD病理進程中，更多的APP經(jīng)β-裂解酶裂解產(chǎn)生C99片段，再經(jīng)γ-裂解產(chǎn)生神經(jīng)毒性物質(zhì)Aβ，可見BACE1在AD病理中扮演著重要角色。對11月齡APP/PS1雌性小鼠的研究證實，上調(diào)BACE1，腦內(nèi)Aβ沉積增多，下調(diào)BACE1，腦內(nèi)Aβ沉積減少（Li et al.，2015）。該研究結(jié)果提示，BACE1是介導(dǎo)腦內(nèi)Aβ沉積的關(guān)鍵，BACE1的表達變化可作為評價AD病理的一個重要指標(biāo)。

本研究證實，6月齡APP/PS1小鼠海馬BACE1基因mRNA和蛋白表達均顯著高于WTC組，大腦海馬區(qū)Aβ蛋白增多，SPs增多，提示，6月齡APP/PS1小鼠海馬β-裂解作用增強。然而也有研究顯示，6月齡APP/PS1小鼠腦Aβ沉積增多，SPs周圍BACE1聚集增多，學(xué)習(xí)記憶能力下降，但與野生對照組相比，BACE1蛋白表達未表現(xiàn)出顯著性差異（Luo et al.，2016）。進一步分析認為，檢測組織不同可能是造成檢測結(jié)果不同的主要原因，該研究檢測組織為全腦，而本研究檢測的是海馬組織，海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，在衰老和AD病程中，海馬首先受到侵害。6月齡APP/PS1小鼠可能尚未表現(xiàn)出全腦BACE1蛋白上調(diào)，如腦干、小腦等腦區(qū)尚未發(fā)生相應(yīng)的病理學(xué)變化，當(dāng)提取整個腦組織蛋白時，其海馬BACE1蛋白的有限上調(diào)可能會被全腦組織蛋白所稀釋。

下調(diào)BACE1可能有利于AD病理改善。對7月齡APP/PS1小鼠補充8周葉酸可顯著下調(diào)BACE1基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，減少腦內(nèi)Aβ，改善AD病理（Tian et al.，2016）。5個月中等強度跑臺運動可降低10月齡APP/PS1小鼠海馬及皮質(zhì)BACE1蛋白，減少Aβ沉積（Zhang et al.，2017）。與上述結(jié)果一致，本研究證實，12周跑臺運動可顯著降低6月齡APP/PS1小鼠海馬BACE1基因的mRNA和蛋白表達，下調(diào)海馬Aβ蛋白，減少SPs。提示，跑臺運動可通過下調(diào)海馬BACE1，改善APP/PS1小鼠病理。近期有研究認為，運動對BACE1的下調(diào)效應(yīng)僅對大腦功能受損組有效，而對正常組無效（Alkadhi et al.，2018），本研究也證實，12周跑臺運動并未改變WTC組小鼠海馬BACE1基因的mRNA和蛋白水平。提示，12周跑臺運動可能對正常組小鼠海馬APP代謝無顯著影響，這可能與正常組小鼠海馬APP及BACE1表達較低，尚處于正常生理代謝范圍有關(guān)。

3.2 運動對小鼠海馬AMPK-BACE1通路影響的整體分析

海馬能量代謝減退可能參與了APP/PS1小鼠的病理進程，能量代謝不足可上調(diào)Aβ的產(chǎn)生和沉積。有研究認為，能量代謝應(yīng)激造成腦內(nèi)Aβ增多的分子機制與AMPKBACE1通路有關(guān)（Wang et al.，2013）。其分子機理為，能量代謝應(yīng)激可造成AMPK活性下降，繼而引起Sirt1表達下降，造成Sirt1去乙?；饔脺p弱，下調(diào)PPARγ及PGC1α的蛋白表達。而后兩者是BACE1基因表達的關(guān)鍵抑制因子，二者可與BACE1基因啟動子區(qū)的PPRE和YY1位點結(jié)合，抑制BACE1基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯。但在衰老及AD大腦中，由于AMPK活性下降，Sirt1表達下降，引起PPARγ和PGC1α表達下降，造成其對BACE1基因的轉(zhuǎn)錄抑制效應(yīng)減弱，導(dǎo)致BACE1表達上調(diào)，最終增強APP的β-裂解，這被認為是能量代謝應(yīng)激上調(diào)Aβ，加劇AD病理的分子機制。本研究證實，與同窩WT小鼠相比，6月齡APP/PS1小鼠海馬ATP減少，AMP/ATP降低，p-AMPK降低，Sirt1、PPARγ、PGC1α蛋白表達下降，BACE1基因的mRNA和蛋白表達水平均表現(xiàn)為上調(diào)，與上述研究結(jié)果一致。本研究同時證實，APP/PS1小鼠海馬SPs增多，進一步印證，該模型小鼠海馬BACE1表達上調(diào)，APP的β-裂解作用增強。綜上提示，海馬能量代謝減退，可通過AMPK-BACE1通路增加6月齡APP/PS1小鼠Aβ生成，這可能是該模型小鼠腦內(nèi)Aβ增多的重要機制。運動可改善腦內(nèi)能量代謝，降低腦內(nèi)Aβ沉積。有研究證實，12周跑臺運動可上調(diào)12月齡APP/NSE雌性小鼠腦Sirt1、PGC1α蛋白表達，下調(diào)BACE1蛋白表達，最終減少Aβ生成（Koo et al.，2017）。本研究也證實，12周跑臺運動可提高APP/PS1小鼠海馬ATP含量，增加AMP/ATP比值，上調(diào)AMPK、p-AMPK、Sirt1、PPARγ、PGC1α等蛋白表達水平，下調(diào)BACE1基因的mRNA和蛋白表達水平，最終表現(xiàn)為海馬區(qū)Aβ沉積的減少。綜上研究提示，運動下調(diào)APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ，可能和運動激活A(yù)MPK，改善AMPK-BACE1通路，下調(diào)BACE1表達有關(guān)，這可能是連接“運動-腦能量代謝-Aβ-腦認知功能”的一個直接通路。

4 結(jié)論

6月齡APP/PS1小鼠海馬Aβ增多的機制可能和AMPKBACE1通路異常有關(guān)，即AMP/ATP下降，AMPK磷酸化水平降低造成其活性減弱，進而下調(diào)Sirt1、PPARγ、PGC1α等蛋白表達，引起B(yǎng)ACE1基因表達增高，上調(diào)APP的β-裂解作用，最終導(dǎo)致Aβ增多。

12周跑臺運動減少6月齡APP/PS1小鼠海馬Aβ的分子機制可能和運動改善AMPK-BACE1通路有關(guān)，即運動增加AMP/ATP比值，上調(diào)AMPK磷酸化水平，增強AMPK活性，繼而上調(diào)Sirt1、PPARγ、PGC1α蛋白表達，引起B(yǎng)ACE1基因表達下降，減弱APP的β-裂解，最終減少Aβ的生成和沉積。