比率熒光法傳感pH檢出限的探討

文慧 劉珣 張尚青 楊婷 陳明麗 王建華

摘 要 檢出限是判斷或評(píng)價(jià)一種分析方法靈敏度的重要參數(shù)，與普通熒光探針相比，比率型熒光探針檢出限的計(jì)算則比較復(fù)雜，多數(shù)情況下采用空白標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值作為檢出限。而當(dāng)比率熒光探針用于pH檢測(cè)時(shí)，檢出限尚無統(tǒng)一定義。本研究通過歸納總結(jié)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)檢測(cè)所得數(shù)據(jù)形式，可將比率型熒光探針分為3種，并據(jù)此設(shè)計(jì)了一種激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為600 nm/450 nm的模擬探針。通過對(duì)3種不同類型的pH比率型熒光探針檢測(cè)的模擬數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以光譜方法的檢出限計(jì)算公式為原型，提出了檢出限的計(jì)算公式。本方法可用于不同種類pH比率型探針方法靈敏度的比較。

關(guān)鍵詞 比率型熒光探針; pH傳感; 靈敏度; 模擬數(shù)據(jù)

1 引 言

熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于溫度[1]、pH[2～4]、環(huán)境污染物[5，6]、重金屬離子[7，8]、生物小分子[9～11]、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)[12，13]的傳感分析，以及生物體[14]和細(xì)胞[15～17]成像。比率型熒光法以兩個(gè)不同波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度的比值作為響應(yīng)信號(hào)，使得分析方法本身受外部環(huán)境等因素的影響大大減小。因此，比率熒光法的樣品適用范圍比直接熒光光譜分析法更廣泛，通常具有更高的靈敏度和更好的選擇性[18，19]。根據(jù)兩個(gè)波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)的不同，可將比率型熒光探針分為四類：（1）一個(gè)波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度不變，另一個(gè)波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度變小[20，21];（2）一個(gè)波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度不變，另一個(gè)波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度變大[22];（3）一個(gè)波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度變小，另一個(gè)波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度變大[14，23];（4）兩個(gè)波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度同時(shí)變大或變小[24]。

國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）1998年發(fā)表的《分析術(shù)語綱要》中規(guī)定：“檢出限（LOD）以濃度或質(zhì)量表示，是指由特定的分析步驟能夠合理地檢測(cè)出的最小分析信號(hào)x求得的最低濃度c（或質(zhì)量q）”。具體到光譜分析方法，科研人員通常采用分析物產(chǎn)生信號(hào)為噪聲信號(hào)3倍的表達(dá)方式。而pH檢測(cè)與傳統(tǒng)的檢測(cè)不同，它不以某種分析物的濃度為量綱，因此，pH檢測(cè)應(yīng)該以最小能夠響應(yīng)的pH單位為檢出限。檢出限是判斷或評(píng)價(jià)一種分析方法靈敏度的重要參數(shù)，比率型熒光探針LOD的計(jì)算則比較復(fù)雜。在已報(bào)道過的文獻(xiàn)中，關(guān)于比率型探針LOD的計(jì)算方法有多種，比較常見的表達(dá)方式包括：空白標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍（3σ）[25]、標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率[21]、空白標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍（3σ）與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值[26，27]和信噪比的3倍[8，9]等。其中，空白標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值是光譜分析中比較認(rèn)可的檢出限計(jì)算方法。而在比率熒光pH傳感方法中沒有空白樣品，所以空白標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值的算法無法應(yīng)用，目前文獻(xiàn)中常用的靈敏度表征參數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，即△Ratio/△pH。

靈敏度是指某方法對(duì)單位濃度或單位量待測(cè)物質(zhì)變化所致的響應(yīng)量變化程度，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，因此，在多數(shù)情況下會(huì)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率直接表征熒光探針的靈敏度，但是，僅用標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率表征比率熒光pH傳感方法的檢出限難以正確評(píng)價(jià)同類方法的靈敏度，對(duì)比較不同方法間的靈敏度造成困擾。如前述熒光探針中的第（1）類，ΔRatio/ΔpH多數(shù)情況下均小于1; 而對(duì)于第（2）類，ΔRatio/ΔpH多數(shù)情況下均大于1。若僅用ΔRatio/ΔpH表征，則第（2）類方法的靈敏度多數(shù)情況下均優(yōu)于第（1）類，這種結(jié)論顯然不正確。由此可見，熒光探針響應(yīng)信號(hào)不同，導(dǎo)致比率熒光ΔRatio之間相差較大，在這4種分類中，有時(shí)整個(gè)線性區(qū)間對(duì)應(yīng)的ΔRatio包含1，無論是直接用ΔRatio/ΔpH，還是用1/（ΔRatio/ΔpH）表征方法檢出限，均不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)同類方法的靈敏度。

本研究以比率熒光法傳感測(cè)定pH時(shí)常遇到的3種情況為例，基于模擬的檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)，探討了表征比率熒光法檢出限的方法，提出了適用于不同情況的計(jì)算比率熒光方法檢出限的方案。本方法可用于同類比率熒光pH傳感方法檢出限的比較，以合理評(píng)價(jià)方法靈敏度。由于在非比率熒光pH傳感中也涉及無空白樣品的問題，因此，本方法同樣適用于非比率熒光pH傳感方法檢出限的計(jì)算及比較。

2 原理和方法

通常，光譜方法的檢出限計(jì)算公式為：LOD=3σ/K其中，其中，σ為空白樣品多次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差;K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

比率型熒光探針LOD的計(jì)算在本質(zhì)上與常見的熒光探針相同。根據(jù)比率型熒光探針的變化形式，比率熒光探針可分為4類，其所獲得的檢測(cè)數(shù)據(jù)可歸結(jié)為3種：第Ⅰ種，信號(hào)比率值Ratio>1;第Ⅱ種，信號(hào)比率值Ratio<1;第Ⅲ種，信號(hào)比率值Ratio包含1。因此，建立一種合適的檢出限計(jì)算方法，即可對(duì)不同的比率熒光傳感pH方法的靈敏度進(jìn)行比較。

本研究假設(shè)有一種激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為600 nm/450 nm的熒光探針，其450 nm處的熒光強(qiáng)度保持不變。根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)可能出現(xiàn)的形式，模擬出3種不同形式的6個(gè)比率型熒光探針的檢測(cè)數(shù)據(jù)。以相關(guān)參考文獻(xiàn)中pH探針的類型為依據(jù)，設(shè)計(jì)出各探針的檢測(cè)范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上選取合適的數(shù)據(jù)點(diǎn)后，再按照模擬探針本身的特點(diǎn)要求，通過倒推的方法獲得模擬數(shù)據(jù)。對(duì)比模擬數(shù)據(jù)，探討不同形式的比率熒光探針用于pH傳感時(shí)，方法的檢出限計(jì)算方案。

3 結(jié)果與討論

3.1 比率信號(hào)值均大于1

以比率信號(hào)值均大于1的情況為例進(jìn)行計(jì)算。Liu等[21]以上轉(zhuǎn)換納米粒子為核心，二氧化硅為殼層，在二氧化硅表面偶聯(lián)BSA，合成了核-殼-殼結(jié)構(gòu)，在殼層表面結(jié)合pH敏感型染料，即可獲得比率型pH熒光探針。 本研究選用Ratio為540 nm處的熒光強(qiáng)度與655 nm處的熒光強(qiáng)度的比值（I540 nm/I655 nm），結(jié)果表明， 此探針的比率信號(hào)值均大于1。本研究以真實(shí)探針熒光光譜圖的類型為基礎(chǔ)，虛構(gòu)了和它相同類型的模擬探針的熒光光譜圖，如圖1所示。

X模擬的探針發(fā)射波長(zhǎng)在450 nm處的熒光強(qiáng)度保持不變，600 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增大，且均大于450 nm處的熒光強(qiáng)度，因此，比率信號(hào)值均大于1。后續(xù)其它各類型的模擬探針數(shù)據(jù)均采用此方法獲得，為了保持本研究討論的一致性，無論何種類型的熒光探針，均假定其激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為600 nm/450 nm，且450 nm處的熒光強(qiáng)度不變。

以Ratio（I600 nm/I450 nm）為縱坐標(biāo)，pH值為橫坐標(biāo)，建立pH傳感方法，假設(shè)有兩種不同靈敏度的探針A1和A2，其在不同pH值處對(duì)應(yīng)的Ratio（I600 nm/I450 nm）數(shù)據(jù)見表1（探針A1）和表2（探針A2）。兩種探針對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，線性方程分別為YA1=2XA1-4和YA2=XA2-1。

按照“3σ/K”的方式計(jì)算檢出限時(shí)，首先遇到的問題是，對(duì)于pH傳感方法，沒有空白樣品，無法定義空白樣品多次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。本研究推薦的方法為將線性范圍中間值11次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為公式中的σ，探針A1和A2的標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)量結(jié)果如表3所示，對(duì)應(yīng)于探針A1和A2，其標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為σA1=0.4494和σA2=0.1183。根據(jù)線性方程公式，兩個(gè)pH探針對(duì)應(yīng)的傳感方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別為KA1=2和KA2=1。分別計(jì)算兩種方法的檢出限，即可得到LODA1=0.67， LODA2=0.35。

3.3 比率信號(hào)值包含1

相對(duì)于前文中討論的比率信號(hào)值均大于1和均小于1的情況，比率信號(hào)值包含1的情況更為復(fù)雜。Zhang等[28]以分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制和熒光共振能量轉(zhuǎn)移為原理，合成了聚合物膠束比率型熒光探針，用于體內(nèi)內(nèi)源性次氯酸根的傳感。該研究工作選用的Ratio為444 nm與551 nm處熒光強(qiáng)度的比值（I444 nm/I551 nm），探針的比率信號(hào)值均包含1。以Ratio（I600 nm/I450 nm）為縱坐標(biāo)，pH值為橫坐標(biāo)，建立pH傳感方法，假設(shè)有兩種不同靈敏度的探針C1和C2，其在不同pH值處對(duì)應(yīng)的Ratio（I600 nm/I450 nm）數(shù)據(jù)見表8和表9，標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)量結(jié)果見表10。根據(jù)表8和表9數(shù)據(jù)可以得到兩種探針對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)線性方程分別為YC1=0.5XC1-3.05和YC2=2XC2-13.6，其對(duì)應(yīng)斜率分別為KC1=0.5和KC2=2（圖6）。

若僅用標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率K（ΔRatio/ΔpH）衡量方法靈敏度，第Ⅲ種探針的斜率K（ΔRatio/ΔpH）有大于1和小于1的情況，如比較K，那么C2>C1。因此，在前面討論的基礎(chǔ)上，可將數(shù)據(jù)進(jìn)行處理， 再計(jì)算此類型探針的檢出限。

本研究采用部分代表整體的方法得到與第Ⅰ種探針比較的靈敏度，即當(dāng)Ratio>1的部分所占檢測(cè)范圍的比例超過50%時(shí)，則選用第Ⅰ種探針的計(jì)算方法，將Ratio>1的部分看作整體計(jì)算斜率，而當(dāng)Ratio<1的部分所占檢測(cè)范圍的比例超過50%時(shí)，則選用第Ⅱ種探針的計(jì)算方法，將Ratio<1的部分看作整體計(jì)算斜率。對(duì)應(yīng)第Ⅰ種探針中的A1和A2，其用于pH傳感的斜率分別為KA1=2和KA2=1;對(duì)應(yīng)第Ⅱ種探針中的B1和B2，經(jīng)處理后，其用于pH傳感的斜率分別為K′B1=2.79和K′B2=5.23; 經(jīng)處理后的第Ⅲ種探針用于pH傳感的斜率分別為K′C1=1.11和K′C2=2。此時(shí)，若僅比較標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，則對(duì)應(yīng)6個(gè)pH探針的靈敏度順序?yàn)锽2>B1>A1=C2>C1>A2;若同樣以線性范圍中間點(diǎn)多次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為σ，由于計(jì)算斜率時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理，在計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)應(yīng)選擇與斜率相同的計(jì)算方法，即當(dāng)Ratio>1所占比例多時(shí)，可直接使用數(shù)據(jù)列表中的標(biāo)準(zhǔn)偏差;當(dāng)Ratio<1所占比例多時(shí)，選擇分別取倒數(shù)后的數(shù)值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算得到對(duì)應(yīng)的檢出限為L(zhǎng)ODC1=0.04、LODC2=0.12，對(duì)應(yīng)6個(gè)pH探針的檢出限順序?yàn)锳1>A2>C2>B2>B1>C1。

因此，對(duì)于Ratio包含1的情況，可以通過部分代表整體的方式將標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率表達(dá)成與第Ⅰ種探針一致的形式，即使這樣，單純考慮標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的方法也不能全面反映方法的檢出限，用綜合考慮標(biāo)準(zhǔn)偏差（即方法精度）和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（3σ/K）的方式可以較客觀地評(píng)價(jià)方法檢出限。

4 結(jié) 論

本研究針對(duì)pH比率型熒光探針檢出限的計(jì)算提出了一個(gè)數(shù)學(xué)模型，此模型可以橫向比較不同種類的pH比率型熒光探針。以光譜法的檢出限計(jì)算公式為基礎(chǔ)，對(duì)其中的量值進(jìn)行替代， 可得到pH比率型熒光探針的檢出限計(jì)算模型。空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差可直接由檢測(cè)范圍的中間值的標(biāo)準(zhǔn)偏差替代，而標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率則需根據(jù)探針的類型經(jīng)不同數(shù)學(xué)處理后再進(jìn)行替代。根據(jù)探針的種類，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率處理方式分為3種：第Ⅰ種，即Ratio>1時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率可直接替代;第Ⅱ種，即Ratio<1時(shí)，通過對(duì)檢測(cè)范圍兩端的Ratio值取倒數(shù)后， 以兩端為依據(jù)計(jì)算斜率后再替代;第Ⅲ種，即Ratio包含1時(shí)，通過部分代表整體的方法計(jì)算出斜率后再替代。通過對(duì)3種不同類型的pH比率型熒光探針模擬數(shù)據(jù)的計(jì)算討論，表明此計(jì)算模型是合理的，適用于pH比率型熒光探針。事實(shí)上，pH值反映了溶液中H+的濃度，因此以H+濃度或最小能夠響應(yīng)的pH單位作為檢出限的表達(dá)更為合理，本研究?jī)H針對(duì)目前pH傳感時(shí)檢出限表達(dá)不一致的情況，提出了一種相對(duì)合理的統(tǒng)一方法，更加科學(xué)合理地表達(dá)pH檢出限仍需進(jìn)一步的研究討論。

References

1 Zaibudeen A W， Philip J. Sens. Actuators B， 2018， 268： 338-349

2 Casey J R， Grinstein S， Orlowski J. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.，? 2010，? 11（1）： 50-61

3 Li H Y， Wei Y L， Dong X Y， Zang S Q， Mak T C W. Chem. Mater.，? 2015，? 27（4）： 1327-1331

4 Hou J R， Jin D， Chen B， Si L L， Jin Y H， Chen L G， Yan X L， Wang B W， Li Y. Chinese Chem. Lett.，? 2017，? 28（8）： 1681-1687

5 Lin W， Long L， Chen B， Tan W. Chemistry，? 2009，? 15（10）： 2305-2309

6 Rong M， Lin L， Song X， Zhao T， Zhong Y， Yan J， Wang Y， Chen X. Anal. Chem.，? 2015，? 87（2）： 1288-1296

7 Lu W， Qin X， Liu S， Chang G， Zhang Y， Luo Y， Asiri A M， Al-Youbi A O， Sun X. Anal. Chem.，? 2012，? 84（12）： 5351-5357

8 Zhang Z， Wu Y， He S， Xu Y， Li G， Ye B. Anal. Chim. Acta，? 2018，? 1014： 85-90

9 Li H， Zhao Y， Chen Z， Xu D. Biosens. Bioelectron.，? 2017，? 87： 428-432

10 Xu Y， Niu X， Zhang H， Xu L， Zhao S， Chen H， Chen X. J. Agric. Food Chem.，? 2015，? 63（6）： 1747-1755

11 Chen H， Tang Y， Ren M， Lin W. Chem. Sci.，? 2016，? 7（3）： 1896-1903

12 Yin C， Zhen X， Fan Q， Huang W， Pu K. ACS Nano，? 2017，? 11（4）： 4174-4182

13 Lippert A R， New E J， Chang C J. J. Am. Chem. Soc.，? 2011，? 133（26）： 10078-10080

14 Nareoja T， Deguchi T， Christ S， Peltomaa R， Prabhakar N， Fazeli E， Perala N， Rosenholm J M， Arppe R， Soukka T， Schaferling M. Anal. Chem.，? 2017，? 89（3）： 1501-1508

15 Li G， Fu H， Chen X， Gong P， Chen G， Xia L， Wang H， You J， Wu Y. Anal. Chem.，? 2016，? 88（5）： 2720-2726

16 Liu R， Zhang L， Chen Y， Huang Z， Huang Y， Zhao S. Anal. Chem.，? 2018，? 90（7）： 4452-4460

17 Pak Y L， Park S J， Xu Q， Kim H M， Yoon J. Anal. Chem.，? 2018，? 90（15）： 9510-9514

18 Lee M H， Kim J S， Sessler J L. Chem. Soc. Rev.，? 2015，? 44（13）： 4185-4191

19 Huang X， Song J， Yung B C， Huang X， Xiong Y， Chen X. Chem. Soc. Rev.，? 2018，? 47（8）： 2873-2920

20 Yang Q， Ye Z， Zhong M， Chen B， Chen J， Zeng R， Wei L， Li H W， Xiao L. ACS Appl. Mater. Interfaces，? 2016，? 8（15）： 9629-9634

21 Liu X， Zhang S Q， Wei X， Yang T， Chen M L， Wang J H. Biosens. Bioelectron.，? 2018，? 109： 150-155

22 Cao X， Lin W， Yu Q. J. Org. Chem.，? 2011，? 76（18）： 7423-7430

23 Ahn H， Hong J， Kim S Y， Choi I， Park M J. ACS Appl. Mater. Interfaces，? 2015，? 7（1）： 704-712

24 Pratiwi F W， Hsia C H， Kuo C W， Yang S M， Hwu Y K， Chen P. Biosens. Bioelectron.，? 2016，? 84： 133-140

25 Yang X F， Qi H， Wang L， Su Z， Wang G. Talanta，? 2009，? 80（1）： 92-97

26 Chang C， Wang F， Qiang J， Zhang Z， Chen Y， Zhang W， Wang Y， Chen X. Sens. Actuators B，? 2017，? 243： 22-28

27 Gong Y J， Zhang X B， Zhang C C， Luo A L， Fu T， Tan W， Shen G L， Yu R Q. Anal. Chem.，? 2012，? 84（24）： 10777-10784

28 Zhang P， Wang H， Hong Y， Yu M， Zeng R， Long Y， Chen J. Biosens. Bioelectron.，? 2018，? 99： 318-324