乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌的microRNA標(biāo)志物篩選及臨床早期預(yù)測(cè)研究

吳龍 劉晨 蔣宏傳

[摘要] 目的 利用miRNA芯片研究乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌患者中差異表達(dá)的microRNAs及其相關(guān)性，為乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌的早期預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。 方法 選擇2000年1月～2014年12月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院就診的乳腺癌患者為研究對(duì)象，以乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌者為實(shí)驗(yàn)組，并以乳腺癌術(shù)后并發(fā)婦科良性疾患者（良性對(duì)照組）和乳腺癌術(shù)后無(wú)婦科疾患者（單發(fā)乳腺癌對(duì)照組）為對(duì)照，采用miRNA芯片和qRT-PCR技術(shù)，篩選并分析各組間差異表達(dá)的miRNAs。 結(jié)果 miRNA芯片檢測(cè)得到系列差異表達(dá)的miRNAs，其中miR-1234差異表達(dá)最顯著，利用qRT-PCR對(duì)miR-1234表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果也顯示，實(shí)驗(yàn)組中miR-1234表達(dá)水平顯著高于良性對(duì)照組和單發(fā)乳腺癌對(duì)照組（P < 0.05），并且miR-1234用于乳腺癌術(shù)后卵巢癌的早期預(yù)測(cè)的敏感性和特異性均為80%。 結(jié)論 miR-1234在乳腺癌術(shù)后罹患卵巢癌患者與乳腺癌術(shù)后未患卵巢癌患者中表達(dá)差異最為明顯，有望成為乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌早期預(yù)測(cè)的腫瘤標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] 乳腺-卵巢雙原發(fā)癌;miR-1234;腫瘤標(biāo)志物;預(yù)防性切除

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.9? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）03（a）-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the differential expression of microRNAs and their correlation in patients with ovarian cancer after breast cancer operation by miRNA microarray， and to provide early prediction of postoperative ovarian cancer. Methods The patients with ovarian cancer who were admitted to Beijing Chaoyang Hospital， Capital Medical University from January 2000 to December 2014 were enrolled as research objects. The patients with ovarian cancer after breast cancer surgery were regarded as experimental group， patients with complication of benign gynecological tumors followed by breast cancer （benign control group） and patients with no any abnormal after breast cancer surgery （single breast cancer control group） were regarded as control. The miRNA microarray and qRT-PCR were used to detect the differentially expressed miRNA levels among the groups. Results A series of differentially expressed miRNAs were detected by miRNA microarray， among which miR-1234 was the most significantly differentially expressed， and the results of verification of miR-1234 expression by qRT-PCR also showed that the expression level of miR-1234 in the experimental group was significantly higher than that in the benign control group and the single breast cancer control group （P < 0.05）. The sensitivity and specificity of early prediction of ovarian cancer after breast cancer surgery by using miR-1234 were 80%. Conclusion miR-1234 is the most obvious difference between patients with ovarian cancer after breast cancer surgery and those without ovarian cancer after breast cancer surgery. It is expected to be a tumor marker for early prediction of ovarian cancer after breast cancer operation.

[Key words] Breast-ovarian double primary cancer; miR-1234; Tumor marker; Preventive resection

乳腺癌是最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤[1]，而卵巢癌是致死率最高的女性生殖道腫瘤[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者術(shù)后卵巢癌的患病率較普通人群明顯增高，對(duì)乳腺癌患者預(yù)防性切除子宮和附件可以避免再次罹患卵巢癌的發(fā)生[3-4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于乳腺癌、卵巢癌和乳腺-卵巢雙原癌的研究大多集中在基因水平，研究較多的為BRCA1/2基因[5-6]、K-Ras基因[7]、RAD51C基因[8]等，但諸多乳腺癌卵巢癌相關(guān)基因，如BRCA1/2，為大型基因，突變位點(diǎn)眾多，且中國(guó)人群尚無(wú)被證實(shí)的熱點(diǎn)位點(diǎn)，檢測(cè)花費(fèi)巨大[9]。另外，雖然基因檢測(cè)具有較好的預(yù)測(cè)性，即基因突變陽(yáng)性時(shí)，對(duì)乳腺癌或卵巢癌的患病風(fēng)險(xiǎn)值預(yù)測(cè)較高，但其檢出率較低[10-12]。microRNA（miRNA）是一類(lèi)由約22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，其通過(guò)調(diào)控人體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后[13-14]。miRNA在外周血中穩(wěn)定存在，檢出譜系廣、靈敏度高、核苷酸序列短、檢測(cè)成本較低，可作為理想的腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤的早期預(yù)測(cè)[15-17]。

目前乳腺癌患者術(shù)后并發(fā)卵巢癌的相關(guān)miRNA鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在尋找可應(yīng)用于臨床的腫瘤標(biāo)志物，確定乳腺癌術(shù)后罹患卵巢癌的高危個(gè)體，為其預(yù)防性切除提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2000年1月～2014年12月于北京朝陽(yáng)醫(yī)院乳腺外科病理確診并規(guī)范治療的乳腺癌患者為研究對(duì)象，根據(jù)其隨診情況進(jìn)行分組。將乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌者納入實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組患者經(jīng)高年資病理科醫(yī)師行病理診斷，排除轉(zhuǎn)移性腫瘤情況;按照匹配因素將相匹配的乳腺癌術(shù)后未并發(fā)婦科惡性腫瘤者納入對(duì)照組，將乳腺癌術(shù)后并發(fā)婦科良性疾患（子宮內(nèi)膜息肉、子宮肌瘤等）者納入良性對(duì)照組，將乳腺癌術(shù)后無(wú)婦科疾患者納入單發(fā)乳腺癌對(duì)照組。匹配因素：年齡相近（±5歲），與實(shí)驗(yàn)組手術(shù)時(shí)間相近（±5年）。

1.2 方法

1.2.1 miRNA芯片技術(shù)篩選目標(biāo)miRNA? 首先設(shè)計(jì)并合成一段通用標(biāo)簽，在5′端修飾熒光分子，再依據(jù)miRNA文庫(kù)中的miRNA序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針，探針的5′端是polyA10，中間一段序列與miRNA互補(bǔ)，3′端的一段序列與通用標(biāo)簽互補(bǔ)，探針的5′端進(jìn)行氨基修飾。同時(shí)制備醛基化基片，將探針溶解于點(diǎn)樣緩沖液中，點(diǎn)樣制備寡核苷酸陣列。將提取好的總RNA與通用標(biāo)簽一并溶解于雜交溶液中，與探針陣列雜交。漂洗除去多余的樣品及通用標(biāo)簽，最后采用掃描儀對(duì)信號(hào)檢測(cè)并進(jìn)行分析，判斷miRNA的表達(dá)譜。

1.2.2 血漿RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）? 按照TRIzol LS試劑盒（北京賽因百奧生物技術(shù)公司）說(shuō)明提取血漿總RNA，并利用First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括總RNA 2 μL、人miRNA RT引物或U6 snRNA RE引物1.2 μL、200 U/μL的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.2 μL、2×Buffer 10 μL，加DEPC水至總體積20 μL;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為26℃ 30 min，42℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，85℃酶失活10 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃下保存?zhèn)溆谩＠肦eal-Time PCR Master Mix（蘇州吉瑪基因）進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL、定量PCR Master Mix 10 μL、2.5 U/μL的Taq DNA 聚合酶0.4 μL、20 μmol/L的mRNA正向引物0.8 μL、20 μmol/L的mRNA反向引物0.8 μL，加去離子水至總體積20 μL。所有操作按照廠家提供說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所用引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，然后再95℃變性30 s，62℃退火延伸40 s，循環(huán)40次。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GenePix 6.0軟件、EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于miRNA表達(dá)譜結(jié)果分析，先對(duì)miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。均一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行兩種分析，①臨床配對(duì)比較：組內(nèi)各樣本作為單獨(dú)個(gè)體，根據(jù)臨床因素進(jìn)行組間嚴(yán)格配對(duì)，進(jìn)行差異miRNA的篩選，利用配對(duì)t檢驗(yàn)計(jì)算其P值。在5個(gè)配對(duì)中都差異表達(dá)[差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）>1.5或FC<1/1.5、P < 0.1]的miRNA，作為顯著差異表達(dá)的miRNA。②組間比較：對(duì)各組內(nèi)同一個(gè)miRNA在5個(gè)樣本中的表達(dá)量求平均值，然后三組間再兩兩比較，進(jìn)行差異miRNA的篩選，F(xiàn)C>1.5或<1/1.5、P < 0.1的miRNA，作為顯著差異表達(dá)的miRNA。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，篩查階段組間比較FC采用配對(duì)t檢驗(yàn);臨床配對(duì)比較FC與組間比較FC的相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)分析;驗(yàn)證階段對(duì)三組樣品行單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)miR-1234用于早期診斷的價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況分析

本研究共納入樣本量15例，術(shù)后病理結(jié)果示，乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌者（實(shí)驗(yàn)組）5例，術(shù)后并發(fā)婦科良性疾患者（良性對(duì)照組）5例，乳腺癌術(shù)后無(wú)婦科疾患者（單發(fā)乳腺癌對(duì)照組）5例。三組患者年齡及乳腺癌發(fā)病年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。見(jiàn)表2。

2.2 miRNA差異表達(dá)譜

在臨床配對(duì)比較中，a：實(shí)驗(yàn)組和良性對(duì)照組組間差異表達(dá)明顯的miRNA有25個(gè);b：實(shí)驗(yàn)組和單發(fā)乳腺癌對(duì)照組組間差異表達(dá)明顯的miRNA有5個(gè);c：?jiǎn)伟l(fā)乳腺癌對(duì)照組和良性對(duì)照組組間差異表達(dá)明顯的miRNA有2個(gè);a和b間共有的差異表達(dá)的miRNA有3個(gè);a和c間共有的差異表達(dá)明顯的miRNA有2個(gè)。提示臨床配對(duì)中差異表達(dá)明顯的miRNA有25個(gè)。見(jiàn)圖1。

在組間比較中，a：實(shí)驗(yàn)組和良性對(duì)照組組間差異表達(dá)明顯的miRNA有69個(gè);b：實(shí)驗(yàn)組和單發(fā)乳腺癌對(duì)照組組間差異表達(dá)明顯的miRNA有5個(gè);c：?jiǎn)伟l(fā)乳腺癌對(duì)照組和良性對(duì)照組組間差異表達(dá)明顯的miRNA有27個(gè);a和b間共有的差異表達(dá)明顯的miRNA有4個(gè);a和c間共有的差異表達(dá)明顯的miRNA有12個(gè);b和c間共有的差異表達(dá)明顯的miRNA有1個(gè)。綜上所述，組間比較中差異表達(dá)明顯的miRNA有57個(gè)。見(jiàn)圖2。

差異表達(dá)明顯的11個(gè)miRNA均上調(diào)表達(dá)，其P值均<0.1，其中hsa-miR-3196、hsa-miR-6089、hsa-miR-762、hsa-miR-4271、hsa-miR-2861的P值<0.05。臨床配對(duì)比較中FC為（16.93±16.74），前5位miRNA是hsa-miR-1234、hsa-miR-6086、hsa-miR-4447、hsa-miR-4271、hsa-miR-4472，其FC分別為57.70、38.55、17.52、15.80、15.04倍。組間比較統(tǒng)計(jì)分析出的FC為（6.75±3.37），前5位miRNA是hsa-miR-1234、hsa-miR-658、hsa-miR-4447、hsa-miR-92a-2-5p、hsa-miR-4472，其差異表達(dá)倍數(shù)分別為14.90、8.14、7.56、7.49、7.38倍。見(jiàn)表3。

經(jīng)直線相關(guān)分析，臨床配對(duì)比較中FC與組間比較FC呈正相關(guān)（r = 0.823，P = 0.002），隨著臨床配對(duì)比較中FC的增加，組間比較FC增加。提示根據(jù)兩種分析方法計(jì)算出來(lái)的FC雖然不同，但差異趨勢(shì)一致。

2.3 qRT-PCR結(jié)果分析

2.3.1 miR-1234表達(dá)分析? 對(duì)質(zhì)量檢測(cè)合格后的qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)組的miR-1234相對(duì)表達(dá)量（4.34±2.12）顯著高于單發(fā)乳腺癌對(duì)照組（0.48±0.22）和良性對(duì)照組（0.33±0.23），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），但良性對(duì)照組與單發(fā)乳腺癌對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.69）。見(jiàn)圖4。

2.3.2 miR-1234用于早期診斷的價(jià)值評(píng)價(jià)? 根據(jù)miR-1234在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（包括良性對(duì)照組和單發(fā)乳腺癌對(duì)照組）中的表達(dá)量，繪制其ROC曲線，計(jì)算曲線下面積，找到最佳cutoff值，計(jì)算在此cutoff值下對(duì)應(yīng)的miRA-1234用于乳腺癌術(shù)后患者卵巢癌的早期診斷的靈敏度和特異度，miRNA-1234用于乳腺癌術(shù)后患者卵巢癌的早期診斷的敏感性和特異性均為80%。見(jiàn)圖5。

3 討論

本研究對(duì)miRNA芯片表達(dá)譜的分析，為組間比較和臨床配對(duì)比較兩者相結(jié)合的方法。既往研究多只應(yīng)用組間比較的方法，因?yàn)槠溥x擇的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組并未進(jìn)行配對(duì)，有的研究實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組病例數(shù)量也不相匹配[13-14]。而本研究根據(jù)患者年齡和乳腺癌手術(shù)時(shí)間進(jìn)行了配對(duì)比較，再結(jié)合組間比較，找出共有的差異表達(dá)的miRNAs，提高了差異表達(dá)miRNA篩選標(biāo)準(zhǔn)，其結(jié)果更有說(shuō)服力。研究結(jié)果顯示，miRNA芯片檢測(cè)得到系列差異表達(dá)的miRNAs，其中miR-1234差異表達(dá)最顯著，利用qRT-PCR對(duì)miR-1234表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果也顯示，實(shí)驗(yàn)組中miR-1234表達(dá)水平顯著高于良性對(duì)照組和單發(fā)乳腺癌對(duì)照組（P < 0.05），并且miR-1234用于乳腺癌術(shù)后卵巢癌的早期預(yù)測(cè)的敏感性和特異性均為80%。

miR-1234作為較新的miRNA，目前在乳腺癌和卵巢癌中研究較少。Kiss等[18]在對(duì)唾液腺來(lái)源的腺樣囊性癌和乳腺來(lái)源的腺樣囊性癌對(duì)比研究中發(fā)現(xiàn)，miR-1234僅在乳腺來(lái)源的腺樣囊性癌中表達(dá)，預(yù)示著miR-1234可能作為區(qū)分唾液腺和乳腺來(lái)源的腺樣囊性癌的標(biāo)志。另外，H?gfeldt等[19]在對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，miR-1234表達(dá)水平與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明STAT3可能是miR-1234的潛在靶標(biāo)。miR-1234可能參與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生，并與環(huán)境背景暴露有關(guān)。而既往相關(guān)研究均表明，STAT3在卵巢癌中持續(xù)性激活，與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)[20-22]。這些結(jié)果提示，miR-1234可能靶向作用于STAT3，從而參與乳腺癌術(shù)后卵巢癌的發(fā)生。

本研究通過(guò)利用miRNA芯片表達(dá)譜檢測(cè)技術(shù)和qRT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌術(shù)后罹患卵巢癌患者與乳腺癌術(shù)后未患卵巢癌患者中存在系列差異性表達(dá)miRNA，其中以miR-1234表達(dá)差異最為明顯，提示其可能在乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌早期預(yù)測(cè)中具有重要作用。

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（收稿日期：2018-05-10? 本文編輯：張瑜杰）