利用PCR-DGGE技術分析內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤細菌的多樣性

武志華,夏冬雙,王雪寒,馬 強,唐 凱,劉惠榮

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,呼和浩特 010018

細菌種類繁多,對環(huán)境、人類和動物既有危害又有用處。一些細菌成為病原體,導致了破傷風、傷寒、肺炎、梅毒、霍亂和肺結(jié)核。在植物中,細菌導致葉斑病、火疫病和萎蔫。但一些細菌可以與酵母菌及其他種類的真菌一起用于發(fā)酵食物,例如奶酪、泡菜、醬油、醋、酒等的制作。細菌也能夠分泌多種抗生素,例如鏈霉素即是由鏈霉菌(Steptomyces)所分泌的。細菌還能降解多種有機化合物,常被用來清除污染,如嗜甲烷菌(Methanotroph)可以分解三氯乙烯和四氯乙烯。在生物科技領域中,細菌也有著廣泛的運用。細菌與人類的生產(chǎn)和生活關系極為密切,因此研究細菌多樣性對于環(huán)境系統(tǒng)十分重要,了解環(huán)境中的優(yōu)勢菌群和功能菌群具有特殊的指導意義。隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展,仍有大量細菌沒有被發(fā)現(xiàn),因而對于細菌的研究與開發(fā)是非常必要的。

內(nèi)蒙古西部地區(qū)地域遼闊,包括阿拉善、鄂爾多斯、烏海、巴彥淖爾和包頭5個盟市,以農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)為基礎產(chǎn)業(yè)[1]。由于所處緯度較高,邊沿有山脈阻隔,氣候以溫帶大陸性季風氣候為主。該地區(qū)地形地貌復雜,有鄂爾多斯高原、河套平原以及陰山山脈[2],且水資源短缺,水土流失和沙漠化嚴重[3]。整個西部地區(qū)以溫帶荒漠區(qū)和溫帶草原區(qū)為主,土壤類型分布較多,包括38個土壤亞類。阿拉善與鄂爾多斯等地區(qū)沙漠化嚴重,以風沙土和灰棕漠土為主；包頭、巴彥淖爾和烏海地區(qū)的土壤主要為栗鈣土、灰鈣土、棕鈣土。土地利用方式多樣,有耕地、林地、牧區(qū)草地、退化草地、荒地等。由于土壤的營養(yǎng)成分含量、有機物的豐富程度、pH的大小、以及土壤植被的不同,都會導致細菌分布的不同[4],也可能存在著特殊類型的細菌。

DGGE技術具有可靠性強、重現(xiàn)性高、方便快捷等優(yōu)點,該技術已經(jīng)被應用于各種環(huán)境下微生物多樣性的研究,如沙漠、海洋、湖泊、沙丘、植物根系土壤等。本研究首次通過PCR-DGGE技術[5- 6]來研究內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤細菌的多樣性,為未來該地區(qū)的細菌資源開發(fā)利用及生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 土壤樣品

根據(jù)內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤類型及土壤利用方式,于2014年與2015年的7—8月份對5個地區(qū)的土壤進行布點采樣,其中阿拉善38份、鄂爾多斯32份、巴彥淖爾45份、烏海14份、包頭41份,共計170份土樣,將其放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?具體采樣信息詳見表1。

表1 土壤樣品信息

續(xù)表樣品編號Sample No.土壤類型Soil type利用類型Utilization type樣品編號Sample No.土壤類型Soil type利用類型Utilization type樣品編號Sample No.土壤類型Soil type利用類型Utilization typeBT-05棕鈣土耕地BM-21棕鈣土草地AL-34灰模土未利用BT-06棕鈣土草地BM-22棕鈣土草地AL-35灰漠土未利用BT-07棕鈣土草地BM-24梭梭林林地AL-36灰漠土耕地BT-08棕鈣土耕地BM-25灰漠土未利用AL-37灰漠土牧區(qū)BT-09棕鈣土林地BM-26風沙土耕地AL-38灰漠土牧區(qū)BT-10栗鈣土耕地BM-27風沙土林地BT-11栗鈣土草地BM-28風沙土草地

AL：阿拉善地區(qū),Alashan region；ERDS：鄂爾多斯地區(qū),Ordos region；WH：烏海地區(qū),Wuhai region；BM：巴彥淖爾地區(qū),Bayan Nur region；BT：包頭地區(qū),Baotou region

1.1.2PCR引物

根據(jù)林海龍等[7]的方法選用適合細菌PCR-DGGE的V3區(qū)特異性引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,詳見表2。

表2 本研究所用的引物

1.2 實驗方法

1.2.1土壤肥力參數(shù)的測定

土壤樣品水分含量的測定采用烘干法[8],pH值的測定參見生態(tài)學常用實驗研究方法與技術[9],有效磷的測定采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法[10],速效鉀的測定采用NaNO3浸提-四苯硼鈉比濁法[11],水解氮的測定采用堿解擴散法[12],有機質(zhì)的測定采用重鉻酸鉀容量法(稀釋熱法)[13]。

1.2.2土壤總DNA提取

由于土壤中的物質(zhì)繁多,而且復雜,其中的蛋白質(zhì)、腐殖質(zhì)等物質(zhì)可能會抑制PCR過程中的關鍵物質(zhì)Taq DNA聚合酶的活性,最終影響到整個實驗的結(jié)果,因此土壤總DNA的提取質(zhì)量是利用PCR-DGGE技術研究微生物多樣性的關鍵環(huán)節(jié),目前土壤總DNA的提取方法可以分為兩種,分別是直接提取與間接提取方法。本研究參照李靖宇等[14]的方法,將其稍加改進,對土壤進行適當?shù)娜コ迟|(zhì)處理。依據(jù)Leff等[15]提取土壤DNA的方法,在溶菌酶之前加入直徑1 mm的玻璃珠,渦旋儀強烈震蕩,以增加DNA的產(chǎn)量。

1.2.3PCR反應條件

采用50 μL反應體系：10×PCR Buffer 5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL,引物(20 μmol/L)各0.4 μL,ExTaq(5 U/μL) 0.4 μL,模板(80 ng/μL) 1 μL,補足滅菌雙蒸水至50 μL。PCR擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 35 s,65—55℃ 40 s,72℃ 50 s,10個循環(huán)(每個循環(huán)退火溫度降低1 ℃)；94℃ 35 s,55℃ 40 s,72℃ 50 s,72℃ 1 min,20個循環(huán)。兩對引物GC-F341/R518與F341/R518的反應體系及PCR擴增條件均相同。

1.2.4DGGE方法

1.2.5DGGE切膠回收

用75%酒精擦拭手術刀片并用酒精燈灼燒,待其冷卻后將目的條帶從凝膠上切下,置于1.5 mL離心管中,加入1 mL去離子水,顛倒洗滌條帶,3000 r/min離心1 min后棄掉去離子水,重復該步驟兩遍。加入50 μL的1×TE緩沖液,以上清液為模板,以不帶GC夾的引物進行相同程序和體系的擴增,所得PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌,然后挑取單克隆進行菌落PCR后送北京華大公司測序。

1.2.6序列分析

將所得測序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序進行分析及相似性比較,并下載同源性最高的核酸序列,利用ClustalX 2.0程序進行比對后,利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.7數(shù)據(jù)處理與分析

使用Quantity One 4.6.2對DGGE圖譜進行分析,采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對土壤樣品的各項參數(shù)進行數(shù)據(jù)處理并對其與細菌多樣性指數(shù)的相關性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤肥力參數(shù)的測定

對內(nèi)蒙古自治區(qū)西部地區(qū)采集的170份土壤樣品的含水量、pH值、有機質(zhì)、有效磷、水解氮以及速效鉀的含量進行了測定,將其分別與全國第二次土壤普查的各級土壤養(yǎng)分指標[17]進行對比,如表3所示,采集的土壤樣品中27.06%為中性土壤,66.47%為微堿性土壤；88.24%的土樣含水量低于16%,處于干旱狀態(tài)；75.38%的土壤樣品的有機質(zhì)含量處于缺乏狀態(tài)；有效磷的含量分布較均勻,每個等級均分布有一定的比例,約41.77%的土樣處于適宜以下的水平；速效鉀的含量分布相對集中,52.94%的土樣處在一個適宜的水平,大約占44.70%的土樣處于缺乏狀態(tài)；而水解氮的含量整體處于一個缺乏的狀態(tài),甚至51.18%的土樣水解氮的含量處于很缺乏的水平。

表3 西部地區(qū)土壤養(yǎng)分分級狀況

根據(jù)土壤類型進行統(tǒng)計分析,表4所示為不同土壤類型肥力參數(shù)均值。粗骨土、栗褐土、灰褐土、草甸土和灰色森林土為中性土壤,其余類型土樣為微堿性土壤；栗褐土的含水量偏高,其余類型土壤均表現(xiàn)出不同程度的干旱狀態(tài)；沼澤土的水解氮含量最高為134.80 mg/kg,處于豐富的水平,灰褐土處于缺乏的狀態(tài),其余土壤處于很缺乏或極度缺乏的狀態(tài)；沼澤土的有機質(zhì)含量同樣也是最高的,為39.00 g/kg,處于豐富的水平,灰褐土與草甸土的有機質(zhì)含量處于適宜的水平,粗骨土與灰鈣土處于很缺乏的狀態(tài),其余土壤處于缺乏的狀態(tài)；雖然粗骨土的有機質(zhì)含量最低,但其有效磷含量最高,為31.61 mg/kg,與潮土、鹽土、栗鈣土、棕鈣土和草甸土均處于豐富的水平,而灰色森林土、沼澤土、灰鈣土、栗褐土均處于極度缺乏的狀態(tài),其余土壤處于缺乏或很缺乏的狀態(tài)；灰褐土、潮土、鹽土、栗褐土與沼澤土的速效鉀含量處于適宜的水平,其余土壤處于缺乏的狀態(tài)。

根據(jù)土壤利用方式對各參數(shù)進行統(tǒng)計分析,如圖1所示。土壤的不同利用方式對pH值的影響并不明顯,而耕地和林地的含水量要高于草地與未利用土壤,未利用土壤含水量最低；對于水解氮的含量,耕地、草地與林地相差不大,但卻都明顯高于未利用土地；速效鉀的含量則均相差較大,由高到低為草地>耕地>林地>未利用土地；未利用土壤、耕地與草地的有機質(zhì)含量無明顯差異,而林地的有機質(zhì)含量明顯高于其他利用方式,這可能是由于其長年落葉導致腐殖質(zhì)的含量明顯高于其他利用方式的土壤；未利用土壤與耕地的有效磷含量無明顯差異,且明顯高于其他利用方式,與林地有機質(zhì)含量最高正相反,該利用方式的土壤樣品的有效磷含量最低。

表4 不同土壤類型肥力參數(shù)均值

小寫字母代表0.05差異顯著性水平

圖 1 土壤不同利用方式對各環(huán)境參數(shù)的影響Fig.1 Impact of different utilization types of soil on environment parameters圖中小寫字母代表0.05差異顯著性水平

2.2 細菌多樣性的分析

2.2.1土壤總DNA提取

本研究采用直接提取方法,在SDS-酶結(jié)合的基礎上對土壤樣品做脫腐處理,經(jīng)過預實驗,對提取到的土壤總DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,顯示條帶不夠明亮,如圖2所示。

本研究采用物理、化學與酶相結(jié)合的實驗方法,又根據(jù)實際情況適當調(diào)整脫腐的次數(shù),最終使提取的土壤總DNA量明顯增加,如圖3所示。其中1號樣品為流動荒漠風沙土,單娜娜等[18]研究表明流動沙土的微生物含量較少,可能是導致優(yōu)化后提取的DNA量仍相對較少的原因。

圖 2 方法優(yōu)化前土壤總DNA提取結(jié)果 Fig.2 DNA extraction of soil samples before the method was optimizedM：DNA Marker；泳道1—7分別為土樣BM33、BT40、BT27、BT16、BT32、AL12、BM9的總DNA

圖3 方法優(yōu)化后土壤總DNA提取結(jié)果 Fig.3 DNA extraction of soil samples after the method was optimizedM：DNA Marker；泳道1—7分別為土樣BM33、BT40、BT27、BT16、BT32、AL12、BM9的總DNA

2.2.216S rRNA 片段的PCR擴增

以提取的土壤總DNA為模板,擴增細菌16S rRNA 基因片段。由于引物前有一段高度重復的GC序列,因此對PCR擴增條件要求很苛刻,通過多次摸索,最終確定了細菌的PCR條件,得到清晰,無雜帶的擴增條帶,如圖4所示,擴增片段大小約為220 bp。

圖4 細菌16S rRNA 片段PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖 Fig.4 PCR products of the bacterial 16S rRNA fragmentsM：DNA Marker；泳道1—12為樣品BT4、BT4、BT14、BT15、BT16、BT8、BT17、BT18、BT19、BT20、 BT23、BT22總DNA為模板的PCR擴增產(chǎn)物

圖5 部分土壤樣品細菌16S rRNA的PCR產(chǎn)物DGGE圖譜 Fig.5 DGGE image of PCR products of bacterial 16S rRNA of partial soil samples圖中1#—12#分別為土樣BT4、空白、BT14、BT15、BT16、BT8、BT17、BT18、BT19、BT20、BT23、BT22 DNA的PCR產(chǎn)物DGGE圖譜

2.2.3PCR產(chǎn)物的DGGE分析

將擴增的細菌16S rRNA 基因片段純化后進行DGGE電泳檢測。圖5為部分樣品的細菌DGGE電泳圖,使用Quantity One 4.6.2 對所有DGGE圖譜進行分析。結(jié)果顯示,內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤樣品的細菌DGGE圖譜中的條帶普遍分布均勻,條帶數(shù)目較多,優(yōu)勢條帶明顯。

圖6所示的為用Quantity one軟件分析圖5后得到的條帶分布及強度示意圖。1#、10#、11#泳道土樣的利用方式均為草地,但1#為栗鈣土,10#為灰褐土,11#為潮土,由圖6可知10#泳道的條帶數(shù)明顯多于11#泳道和1#泳道,且1#泳道的條帶數(shù)最少,說明相同利用方式的不同土壤類型對菌群的多樣性有明顯影響。示意圖中4#、5#、7#泳道為相同土壤類型,但是其條帶數(shù)目與條帶強度明顯不同,4#有24個條帶,5#有32個條帶,而7#泳道有34個條帶,且7#泳道主要分布在膠圖的上半部分,4#與5#主要分布在下半部分,4#與5#的優(yōu)勢條帶大體一致,7#泳道與4#、5#有相同的優(yōu)勢條帶也有不同的優(yōu)勢條帶,由此可知7#土壤菌群分布與4#、5#明顯不同,圖譜中4#為未利用淋浴灰褐土,5#都為耕地淋浴灰褐土,7#為草地淋浴灰褐土,說明不同利用方式對菌群的分布有明顯影響。9#與7#泳道為相同類型土壤,土壤的利用方式也都為耕地,條帶數(shù)與優(yōu)勢條帶基本保持一致,可知微生物類群大致相同。對內(nèi)蒙古西部地區(qū)其他土壤的分析也基本遵循這一規(guī)律。

圖6 部分土壤樣品細菌16S rRNA的PCR產(chǎn)物DGGE電子圖譜(與圖5對應)Fig.6 DGGE electron image of PCR products of bacterial 16S rRNA of partial soil samples(corresponding to figure 5)

2.2.4多樣性指數(shù)分析

將細菌16S rRNA片段的DGGE圖譜進行標準化后通過多樣性指數(shù)的計算以分析不同土壤類型的細菌分布特點,包括香濃指數(shù)(H),豐富度(S),均勻度(Eh)三個指標,如表5所示。香濃指數(shù)是微生物的多樣性指數(shù)[19],其數(shù)值越大多樣性越豐富；豐富度是指一個群落結(jié)構(gòu)中的物種數(shù)目；均勻度指數(shù)越接近1,表明群落結(jié)構(gòu)組成越均勻。將所有土樣按照土壤類型進行歸類,計算平均值后比較,香濃指數(shù)由高到低為新積土、灰鈣土、棕鈣土、栗鈣土、灰褐土、沼澤土、潮土、粗骨土、石質(zhì)土、風沙土、草甸土、鹽土、栗褐土、灰漠土；豐富度由高到低為新積土、棕鈣土、栗鈣土、灰鈣土、沼澤土、灰褐土、潮土、風沙土、粗骨土、石質(zhì)土、草甸土、鹽土、栗褐土、灰漠土；均勻度指數(shù)由高到低為灰漠土、灰鈣土、灰褐土、棕鈣土、潮土、石質(zhì)土、粗骨土、栗褐土、栗鈣土、鹽土、草甸土、風沙土、沼澤土、新積土、灰色森林土。由此可知,新積土中的細菌物種數(shù)目最為豐富,灰鈣土、棕鈣土與栗鈣土的細菌物種數(shù)目次之,也比較豐富,而灰漠土的細菌物種數(shù)目最少,其他土壤類型的居中；所有類型土壤的均勻度指數(shù)均接近于1,說明其群落結(jié)構(gòu)組成都比較均勻,土壤類型對細菌群落結(jié)構(gòu)組成的均勻度影響不明顯。

若將所有土樣按照土壤利用方式進行歸類,對香濃指數(shù)、豐富度以及均勻度三個指標計算平均值后比較,如表6所示。香濃指數(shù)與豐富度由高到低均為耕地土>草地土>林地土>未利用土壤,且耕地、草地與林地土壤樣品的香濃指數(shù)與豐富度相差不多,但都明顯高于未利用土壤的香濃指數(shù)與豐富度,說明這三種土壤利用方式的細菌物種數(shù)目要明顯比未利用土壤的豐富。結(jié)合不同土壤利用方式對各參數(shù)的影響可知,土樣利用方式對水解氮的含量與香濃指數(shù)及豐富度的影響相同,推測在環(huán)境參數(shù)中,水解氮的含量可能是影響細菌香濃指數(shù)與豐富度的主要因素；不同土壤利用方式的均勻度指數(shù)由高到低為未利用土>草地土>耕地土>林地土,但其數(shù)值均接近于1,說明其群落結(jié)構(gòu)組成都比較均勻,土壤利用方式對細菌群落結(jié)構(gòu)組成的均勻度影響不明顯。

表5 不同土壤類型細菌多樣性指數(shù)

小寫字母代表0.05差異顯著性水平

表6 不同土壤利用方式細菌多樣性指數(shù)

小寫字母代表0.05差異顯著性水平

2.2.5系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將內(nèi)蒙古西部地區(qū)所有土壤樣品的DGGE指紋圖譜上的優(yōu)勢條帶進行切膠回收,測序,由于有一部分優(yōu)勢條帶膠回收DNA量沒有達到測序要求,導致測序失敗,只得到大部分優(yōu)勢條帶的測序結(jié)果,將這部分序列在NCBI上與標準菌株比對,選取同源性高的菌株進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。優(yōu)勢條帶膠回收測序后共得到了35個細菌16S rRNA基因序列,選取27個同源性相近的標準菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖7所示。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知,優(yōu)勢菌群大概分為兩簇,其中一簇均與未被培養(yǎng)的標準菌株同源性相近,另外一簇多數(shù)都與可培養(yǎng)的標準菌株同源性相近。優(yōu)勢菌群共劃分為7個門19個屬,分別為Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Nitrospira(硝化螺旋菌門)。其中Proteobacteria(變形菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)為多數(shù)樣品的優(yōu)勢菌群。19個屬分別為Corynebacterium(棒狀桿菌屬)、Sunxiuqinia、Paracoccus(副球菌屬)、Sorangium(堆囊菌屬)、Alicyclobacillus(脂環(huán)酸芽孢桿菌屬)、Reyranalla(未分類螺旋菌目)、Prallserella、Phreatobacter、Stenotrophobacter、Hankyongella、Enhydrobacter(棲水菌屬)、Termodesnlfovibrio、Sphingomonadceae(鞘脂單胞菌屬)、Oxalicibacterium、Rhodococcus(紅球菌屬)、Pesulfotomaculum(脫硫腸桿菌屬)、Paenibacillus(類芽孢桿菌屬)、Burkholderia(伯克氏菌屬)、Pasteurella(巴斯德菌屬),還有兩個Bacteloidets(未分類擬桿菌門)和Alphaproteobacteria(未分類變形菌門),表現(xiàn)出了較高的多樣性。其中與未被培養(yǎng)的菌株親緣關系較近的有10株,占優(yōu)勢菌群的28.6%,其中的八株都集中在發(fā)育樹的同一簇上,表示這些未被培養(yǎng)的優(yōu)勢菌群親緣關系較近。

圖7 土壤細菌16S rRNA-DGGE優(yōu)勢條帶系統(tǒng)進化樹Fig.7 The phylogenetic tree of soil bacterial 16S rRNA-DGGE dominant bands

2.3 細菌多樣性與土壤理化性質(zhì)的關系

將土樣的含水量、pH、有機質(zhì)、水解氮、有效磷和速效鉀的含量與細菌的香濃指數(shù)、豐富度以及均勻度利用SPSS進行相關性分析,結(jié)果如表7所示,香濃指數(shù)、豐富度以及均勻度與pH、含水量、水解氮呈正相關,與有機質(zhì)以及速效鉀的含量呈負相關,但由于相關系數(shù)的絕對值均較低,說明它們之間的相關性并不顯著。

表7 土壤肥力參數(shù)與細菌多樣性指數(shù)的相關系數(shù)(n=109)

3 討論

對內(nèi)蒙古西部地區(qū)的土壤參數(shù)進行分析統(tǒng)計,可知該地區(qū)的土樣基本為中性偏堿性,且土樣的含水量、水解氮、有機質(zhì)和有效磷的含量基本處于適宜以下的水平,而有效鉀的含量則相對較高,處在適宜的水平,但單一元素的適宜并不能改善養(yǎng)分整體的肥力狀況。由趙業(yè)婷[20]對陜西省關中地區(qū)土壤養(yǎng)分進行的分析可知,該地區(qū)有機質(zhì)、速效氮、速效磷及速效鉀的含量分別處于土壤養(yǎng)分分級標準的第5、4、3、2級,即除有機質(zhì)處于缺乏的狀態(tài)外,其他含量均處于適宜及適宜以上的水平。付巧玲[21]在對河南省鄭州市蔬菜基地的土壤資源評價中分析得出該市郊土壤肥力中等,除速效磷含量較低外,其他養(yǎng)分含量中等。相比可知內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤旱化嚴重,土壤肥力水平較低,由此也可以解釋該地區(qū)風沙及沙漠化嚴重、植被退化等一系列的生態(tài)環(huán)境惡化問題。

在對土樣中細菌多樣性的分析后可知,新積土、棕鈣土與栗鈣土的香濃指數(shù)及豐富度均相對較高,栗褐土和灰漠土則相對較低。新積土是由河流流水沉積物或山丘、河谷低處的洪積物和堆積物發(fā)育而成,多數(shù)是肥力水平較高的農(nóng)耕地,而棕鈣土和栗鈣土等是我國北方分布范圍極廣的草原土壤,鈣積作用強,相對西部地區(qū)其他土壤來說較肥沃,同時棕鈣土地區(qū)光熱資源豐富,這都可能是細菌分布較為豐富的主要原因。栗褐土風蝕嚴重,母質(zhì)特征明顯,灰漠土則是石膏鹽層土中稍微濕潤的類型,是溫帶漠境邊緣細土物質(zhì)上發(fā)育的土壤,有鹽化和堿化的缺點,這可能是該類型土壤細菌多樣性指數(shù)較低的原因。

在本研究中,由于土壤利用方式的不同而在相同地區(qū)的相同類型土壤中細菌多樣性出現(xiàn)了一定的差異性,土壤的利用方式不同可能會影響到土壤微生物結(jié)構(gòu)與多樣性,此外,內(nèi)蒙古西部地區(qū)降雨量、溫度與地形等諸多因素都有很大的區(qū)別[22],可能導致不同地區(qū)的相同土壤類型的微生物結(jié)構(gòu)差異很大。研究中發(fā)現(xiàn),相同類型的土壤的整體微生物結(jié)構(gòu)中草地的微生物比耕地的微生物豐富,如本文圖5中4#為未利用淋浴灰褐土,5#都為耕地淋浴灰褐土,7#為草地淋浴灰褐土,7#泳道的細菌條帶數(shù)明顯多于4#與5#泳道。由于內(nèi)蒙古西部地區(qū)地域遼闊,土壤類型眾多,土壤利用方式多樣,加之產(chǎn)生細菌多樣性差異的原因眾多,包括重金屬污染、溫度、鹽度等[23-25]都可能導致細菌多樣性的差異。

經(jīng)過16S rRNA基因序列測序比對后總共得到了7個門的細菌優(yōu)勢條帶,分別為Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Nitrospira(硝化螺旋菌門),共分屬于19個屬,其中Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)與Actinobacteria(放線菌門)的菌種為多數(shù)樣品的優(yōu)勢菌群。以上結(jié)果基本與張星星[26]、張善利[27]等的研究基本一致。吳永勝等[28]對內(nèi)蒙古不同退化階段的荒漠草原進行研究發(fā)現(xiàn)荒漠草原中土壤微生物的數(shù)量最多的為細菌,其中優(yōu)勢菌群為Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)和Firmicutes(厚壁菌門),明顯少于本研究中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢菌群種類。細菌在人類生產(chǎn)生活中扮演著重要的角色,如Proteobacteria(變形菌門)中的粘細菌除了產(chǎn)生可以應用于臨床的抗生素外,還產(chǎn)生與抗腫瘤有關的物質(zhì)[29-30]；Nitrospira(硝化螺旋菌門)中的硝化細菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及氮污染環(huán)境方面都具有重要的作用[31-32],了解這些菌群的分布對于評價內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤環(huán)境穩(wěn)定性以及開發(fā)利用微生物資源都具有重要的指導意義。

本研究發(fā)現(xiàn)土樣的含水量、pH、有機質(zhì)、水解氮、有效磷和速效鉀的含量與細菌的香濃指數(shù)、豐富度以及均勻度之間的相關性并不顯著。楊菁等[33]發(fā)現(xiàn)影響降香黃檀混交林土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和細菌多樣性的主要土壤理化因子除了pH值和有機質(zhì)外,還有脲酶和多酚氧化酶,而這兩項參數(shù)在該研究中并未測定。李鵬等[34]在研究水稻秸稈還田時間對土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)影響時發(fā)現(xiàn)土壤有機碳、pH和速效磷是影響菌群結(jié)構(gòu)及多樣性變異的主要因素；靳正忠等[35]通過探究沙漠人工綠地土壤微生物與環(huán)境因子的關系,認為全氮和速效氮是影響微生物數(shù)量的主要因素；張瑞娟[36]的研究結(jié)果顯示鉀素和氮素對土壤微生物的多樣性影響較大。由此可知土壤中有機質(zhì)、氮、磷、鉀等元素是影響微生物多樣性的重要養(yǎng)分因子。這與本文的研究結(jié)果略有不符,可能是由于影響細菌多樣性的原因眾多,土壤類型與土壤的利用方式也會對其產(chǎn)生影響,而上述研究人員的實驗結(jié)果前提是其采取的土壤樣品多為同一利用方式。此外,也可能還有其他環(huán)境因子的影響,比如微量元素、金屬離子等,但本研究尚未對其進行檢測。

4 結(jié)論

本研究首次對內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤中的細菌多樣性進行了分析。內(nèi)蒙古西部地區(qū)細菌資源較為豐富,其多樣性受到土壤類型及土壤利用方式的顯著影響。該地區(qū)土壤中的優(yōu)勢菌群包括Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Nitrospira(硝化螺旋菌門)。這為今后該地區(qū)的細菌資源開發(fā)利用以及進一步研究其多樣性提供了基礎數(shù)據(jù)。