河北與山西產(chǎn)黃芩藥材中主要黃酮類成分的含量比較研究

申潔，李珮，劉雙雙，李世，王繼永，曾燕，劉海濤，何春年*，孫曉波，肖培根

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.河北旅游職業(yè)學(xué)院，河北 承德 067000；4.中國中藥有限公司，北京 100195

中藥黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，在春秋采集，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，目前為例版《中華人民共和國藥典》所收錄。其性寒、味苦，能清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其主要活性成分為黃酮類化合物，如黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等[1-2]，具有抗氧化[3-4]、抗菌[5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7-8]、保護(hù)肝臟和提高免疫[9-10]等多種藥理活性。

據(jù)賈薔等[11]報(bào)道，在《中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)》中有477個(gè)成方制劑中含有黃芩，包含主治疾病153種。黃芩藥材臨床用量較大，國內(nèi)年需量達(dá)5000多噸[12]。隨著黃芩資源需求量加大，野生資源已不能滿足社會(huì)需求，栽培黃芩已成為我國黃芩藥源的主要來源，國內(nèi)已大量栽培。黃芩主要分布于長江以北大部分省區(qū)及西北和西南地區(qū)，現(xiàn)今習(xí)慣以河北承德為黃芩的道地產(chǎn)區(qū)，并認(rèn)為河北承德黃芩藥材質(zhì)量較好[13]，其以仿野生栽培黃芩為主。另外，現(xiàn)以山西產(chǎn)量大，為人工栽培2～3年生黃芩的主要產(chǎn)區(qū)[14]。目前尚未有針對(duì)兩地黃芩藥材主要化學(xué)成分的對(duì)比研究。

為更加合理的評(píng)價(jià)河北與山西兩個(gè)產(chǎn)區(qū)來源的黃芩藥材的質(zhì)量情況，本課題組系統(tǒng)的收集了河北省承德市的黃芩樣品與山西省的黃芩樣品共32份。采用多組分含量測定的HPLC-DAD的方法，測定了黃芩藥材主要黃酮類化合物的含量，并比較了不同產(chǎn)地、不同年限、不同采收季節(jié)的黃芩藥材主要黃酮化學(xué)成分含量的差異。為黃芩優(yōu)質(zhì)藥材的綜合評(píng)價(jià)進(jìn)一步提供了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

32批黃芩樣品均由本課題組采集或收集，原植物保存于藥用植物研究所親緣中心植物樣品陳列室，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所肖培根研究員鑒定。樣品信息見表1。對(duì)照品野黃芩苷(3)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄苷(4)、黃芩苷(5)、木犀草素(7)、漢黃芩苷(8)、山姜素(9)、芹菜素(10)、黃芩素(11)、漢黃芩素(12)、白楊素(13)和千層紙素A(14)購于中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；異紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(1)、紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(2)、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(6)為本實(shí)驗(yàn)室從黃芩中分離得到，并經(jīng)UV、IR、NMR等譜學(xué)數(shù)據(jù)鑒定，HPLC檢測純度大于95%，其中化合物(1)和(2)為C(2)-R，S構(gòu)型混合物，混合比例為1∶1。甲醇、乙腈為色譜純(Fisher Scientific)；甲酸(CNW公司，德國)；純凈水(Milli-Q，Millipore 公司，美國)。

1.2 儀器

Agilent 1200 HPLC(G1322A型在線脫氣機(jī)、G1311A型液相泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B型DAD檢測器、Agilent色譜工作站)；梅特勒-托利多電子天平(AL204)；C9860A超聲波清洗器(上海杰恩普超聲設(shè)備有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

本實(shí)驗(yàn)方法采用已有的HPLC-DVD方法[15]，該方法基于HPLC-DAD多成分含量測定能夠滿足黃芩藥材樣品的測定，且儀器精密度、方法重復(fù)性、穩(wěn)定性、對(duì)照品線性關(guān)系和加樣回收率等均符合要求。色譜柱為YMC-pack ODS-A(250 mm × 4.6 mm，5m)；流動(dòng)相為甲醇(A)、乙腈(B)和0.1%甲酸水(C)，梯度洗脫，線性洗脫程序?yàn)椋?～60 min，A-B-C(15∶5∶80)到A-B-C(80∶10∶10)。每針進(jìn)樣分析完畢用初始流動(dòng)相平衡15 min再進(jìn)行下一針分析。流速為1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；紫外檢測波長為278 nm；進(jìn)樣體積為10L。用安捷倫工作站Chemstation software(C.01.06)采集數(shù)據(jù)并分析。

2.2 供試品溶液的制備

取黃芩根部干燥樣品，粉碎、過40目篩，精密稱取粉末約0.5 g于50 mL的容量瓶中，精密加入相應(yīng)體積的70%乙醇水，定容至刻度，超聲提取30 min，放置室溫，用70%乙醇水補(bǔ)足減少的體積，0.45m濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取14個(gè)對(duì)照品適量，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻，得到各對(duì)照品的儲(chǔ)備液。將各對(duì)照品的儲(chǔ)備液各取適量后，置10 mL容量瓶中，混勻，并用甲醇定容置刻度，混勻后得混合對(duì)照品的儲(chǔ)備液。所有的對(duì)照品溶液均儲(chǔ)存在4 ℃。

2.4 樣品測定

分別精密稱取表1中的各份樣品約0.5 g，按照2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，按照2.1項(xiàng)下所建立的分析方法進(jìn)行測定，計(jì)算各樣品中測得成分的含量，含量測定結(jié)果見表2。

表1 32批黃芩樣品采集信息

2.5 黃芩藥材中主要黃酮類化合物的含量比較

采于河北省承德縣與山西省的共32批黃芩藥材樣品中，經(jīng)與各標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)共指認(rèn)9個(gè)黃酮類化合物，其他化合物未檢出(黃芩藥材代表性樣品與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1)，該9個(gè)黃酮類化合物含量測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明不同產(chǎn)區(qū)黃芩藥材9個(gè)黃酮類化合物的含量差別較大，各黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為：0.79～5.68 mg·g-1(1)、2.84～14.43 mg·g-1(3)、69.73～147.18 mg·g-1(5)、8.54～35.54 mg·g-1(8)、0.27～2.55 mg·g-1(9)、1.1～18.3 mg·g-1(11)、0.75～7.08 mg·g-1(12)、0.04～1.32 mg·g-1(13)、0.09～2.14 mg·g-1(14)?；衔锖扛叩晚樞蛞来螢辄S芩苷(5)>漢黃芩苷(8)>黃芩素(11)>野黃芩苷(3)>漢黃芩素(12)>異紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(1)>千層紙素A(14)>白楊素(13)。

注：1.異紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；2.紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；3.野黃芩苷；4.芹菜素-7-O-β-D-葡萄苷；5.黃芩苷；6.白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；7.木犀草素；8.漢黃芩苷；9.山姜素；10.芹菜素；11.黃芩素；12.漢黃芩素；13.白楊素；14.千層紙素A。圖1 黃芩代表性樣品(A)與對(duì)照品(B)疊加譜圖

表2 32批黃芩藥材樣品中主要黃酮類化合物含量測定結(jié)果 mg·g-1

續(xù)表2

2.5.1 河北產(chǎn)區(qū)與山西產(chǎn)區(qū)黃芩藥材的黃酮含量對(duì)比分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析了不同產(chǎn)區(qū)、生長年限、采收季節(jié)這些因素對(duì)黃酮類化合物含量的影響，不同產(chǎn)區(qū)黃芩藥材的黃酮含量對(duì)比分析結(jié)果見表3。該統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，河北產(chǎn)區(qū)和山西產(chǎn)區(qū)黃芩藥材中所測得的野黃芩苷與千層紙素A的含量在兩個(gè)地區(qū)間存在顯著差異。另外，兩地區(qū)測定的黃酮總含量不存在顯著性差異。說明兩地黃芩藥材測定的黃酮總含量存在一定的一致性，但從單體黃酮類化合物含量角度出發(fā)，兩地黃芩藥材質(zhì)量卻存在一定的差異性。

表3 不同產(chǎn)區(qū)黃芩藥材中主要黃酮類化合物含量對(duì)比分析 mg·g-1

注：采用Duncan’s multiple range test方差分析，同一列同一濃度不同字母代表在P<0.05水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5.2 不同生長年限黃芩藥材的黃酮含量對(duì)比分析 不同生長年限黃芩藥材的黃酮含量測定結(jié)果見表4，3年生黃芩藥材的黃芩苷、漢黃芩苷含量較高，且與其他年限生長黃芩藥材間存在顯著性差異；不同生長年限黃芩藥材中黃酮類化合物：異紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、山姜素、白楊素、千層紙素A的含量無顯著性差異；3年生黃芩藥材的野黃芩苷含量與2年和7年生的黃芩藥材存在顯著差異，而與1年生黃芩藥材中的含量相近，無顯著差異；7年生黃芩素和漢黃芩苷的含量與其他生長年限的黃芩藥材，含量較高且存在顯著差異。化合物異紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、山姜素、黃芩素、千層紙素A的含量，3年生>2年生>1年生，隨著年限的延長含量呈上升趨勢。測定的各黃酮總含量，3年生黃芩藥材最高，1年生與2年生黃芩藥材總量相近。

2.5.3 不同采收期黃芩藥材的黃酮含量對(duì)比分析 不同采收時(shí)期黃芩藥材的黃酮含量測定結(jié)果見表5，結(jié)果顯示化合物野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的含量在春季和采收的黃芩根部中有顯著性差異，其在春季采收時(shí)含量更高。其他5種黃酮類化合物在不同采收期黃芩藥材中的含量相近，無顯著性差異。春季采收的測得各黃酮總含量與秋季的存在顯著性差異，且前者高于后者。

表4 不同生長年限黃芩藥材的黃酮含量測定結(jié)果 mg·g-1

注：采用Duncan’s multiple range test方差分析，同一列同一濃度不同字母代表在P<0.05水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 不同采收時(shí)期黃芩藥材的黃酮含量測定結(jié)果 mg·g-1

注：采用Duncan’s multiple range test方差分析，同一列同一濃度不同字母代表在P<0.05水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

3.1 黃芩藥材樣品的采集

黃芩藥材樣品的采集地點(diǎn)的選擇合適：產(chǎn)于河北省承德市的熱河黃芩是目前普遍認(rèn)為的道地藥材，在20世紀(jì)30年代，《藥物出產(chǎn)辨》已有記載“直隸、熱河一帶均有出”，而山西雖為非道地黃芩產(chǎn)區(qū)，卻為2～3年生黃芩藥材的主產(chǎn)區(qū)[16]；本研究黃芩樣品采集較為全面和典型：黃芩道地藥材樣品收集全面，系統(tǒng)性的收集了河北省承德市各縣的黃芩藥材。非道地產(chǎn)區(qū)山西則主要采集產(chǎn)量較大的晉中與晉南地區(qū)的黃芩藥材樣品。

3.2 測定結(jié)果分析

本課題組利用建立的測定黃芩植物主要黃酮類化合物的HPLC方法，測定了河北與山西不同產(chǎn)地、不同年限、不同采收季節(jié)的黃芩藥材的9個(gè)黃酮類化合物的含量，并系統(tǒng)地分析了彼此間的差異性。河北省承德市與山西產(chǎn)區(qū)的黃芩藥材中野黃芩苷和千層紙素A的含量存在顯著性差異。另外，綜合兩個(gè)產(chǎn)地測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同生長年限的黃芩藥材中黃酮類化合物的含量存在一定的差異性，其中3年生黃芩藥材的黃芩苷、漢黃芩苷含量較高，與1年生、2年生和7年生的黃芩存在顯著性差異。根據(jù)測得黃酮類化合物的總含量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)3年生>7年生>1年生和2年生，3年生的黃芩藥材品質(zhì)較好，但在黃芩藥材產(chǎn)區(qū)卻以2～3年生黃芩為主，推測因考慮到經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)量，為在保證質(zhì)量的基礎(chǔ)上，大多產(chǎn)區(qū)選擇種植2～3年生的黃芩。對(duì)河北省承德地區(qū)不同采收季節(jié)黃芩藥材黃酮類化合物的含量測定結(jié)果顯示，春季采收的黃芩根部中野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的含量高于秋季采收的黃芩，春季采收的黃芩藥材各黃酮總含量也高于秋季采收黃芩，春季采收的黃芩藥材質(zhì)量較優(yōu)，這可為黃芩藥材的采收季節(jié)提供一定的參考。

據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的黃芩藥材按干燥品計(jì)算，含黃芩苷不得少于9.0%，但在本研究中發(fā)現(xiàn)，若以黃芩苷含量多少為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，不論在黃芩藥材傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)河北省承德市還是非道地產(chǎn)區(qū)山西省，都存在一些樣品不合格的現(xiàn)象，這雖從側(cè)面反映了黃芩藥材存在的質(zhì)量不均一的情況，但以單一成分評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量是否合理需要進(jìn)一步的深入研究。因此為保證藥材品質(zhì)，需要規(guī)范黃芩種植，確定黃芩藥材的最佳采收年限和采收期，也需要更科學(xué)的方法評(píng)價(jià)黃芩藥材的品質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)為此提供了一定的參考和科學(xué)依據(jù)。