YWHAE表達(dá)沉默對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞增殖的影響

黃幼生，解娜，張藝馨，孫芳嬌，羅志飛，薛逢貴

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，海南?？?71101)

YWHAE表達(dá)沉默對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞增殖的影響

黃幼生，解娜，張藝馨，孫芳嬌，羅志飛，薛逢貴

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，海南?？?71101)

目的探討沉默YWHAE表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。方法實(shí)驗(yàn)分為三組，未轉(zhuǎn)染組，構(gòu)建YWHAE短發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)載體及相應(yīng)空載載體，慢病毒包裝后分別感染胃癌MGC803細(xì)胞(干擾組，對(duì)照組)，應(yīng)用Western blot、RT-PCR方法檢測YWHAE沉默效率；MTT技術(shù)觀察YWHAE表達(dá)沉默前后細(xì)胞增殖變化；流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞周期、凋亡及克隆形成變化情況。結(jié)果慢病毒包裝YWHAE-shRNA后成功感染胃癌MGC803細(xì)胞；RT-PCR、Western blot檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，干擾組MGC803細(xì)胞YWHAE基因表達(dá)明顯降低，抑制效率為72.7%。MTT結(jié)果顯示，干擾組細(xì)胞增長速率明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，72 h增長倍數(shù)分別為1.56、2.43，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾組及對(duì)照組克隆形成率分別為6.24%、31.00%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，YWHAE基因表達(dá)沉默后，MGC803細(xì)胞凋亡率增加，由未消減前的3.23%增加到9.83%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；相比對(duì)照組細(xì)胞在G1期的比例(57.88%)，干擾組G1期細(xì)胞比例明顯增加(72.42%)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論沉默YWHAE表達(dá)能抑制胃癌MGC803細(xì)胞增殖，可能與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

YWHAE；胃癌；RNA干擾；細(xì)胞增殖；凋亡

胃癌是我國發(fā)病率及死亡率位居第二的惡性腫瘤，多數(shù)死于胃癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)[1-2]。精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出為晚期胃癌患者的治療提供了方向。例如，曲妥珠單抗赫賽汀靶向治療HER2擴(kuò)增的胃癌患者能夠提高患者3個(gè)月的生存期[3]。然而，特異性分子靶點(diǎn)研究有限，靶向藥物開發(fā)較少，效果不理想。因而，探討胃癌分子機(jī)制、尋找藥物分子靶標(biāo)對(duì)設(shè)計(jì)靶點(diǎn)藥物及提高胃癌治療水平具有重要意義。

14-3-3蛋白家族是一個(gè)由7個(gè)亞型(β、ε、η、γ、τ、ζ和σ)組成、普遍存在又高度保守的酸性蛋白家族，是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中含量最豐富的蛋白之一[4-5]。YWHAE (tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygen-ase activation protein，epsilon polypeptide)基因編碼的14-3-3ε蛋白是其家族中重要的成員之一[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)在肝癌[6]、結(jié)腸癌[7]、胃癌[8]、腎癌[9]等惡性腫瘤中14-3-3ε存在高表達(dá)，高表達(dá)的14-3-3ε可以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和抑制凋亡，其機(jī)制可能是14-3-3ε與CDC25、c-myc、RKIP等蛋白相互作用[8,10-11]，促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換、抑制細(xì)胞凋亡等相關(guān)。YWHAE與胃癌的關(guān)系研究較少，且其在胃癌中的作用還存在爭議，有學(xué)者認(rèn)為，YWHAE在胃癌組織中高表達(dá)，是一個(gè)促癌基因[8]；也有學(xué)者認(rèn)為高表達(dá)的YWHAE具有抑制胃癌細(xì)胞生長的作用，是一個(gè)抑癌基因[12]。

為進(jìn)一步探討、甄別YWHAE與胃癌的關(guān)系，筆者應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默胃癌MGC803細(xì)胞YWHAE基因表達(dá)，觀察YWHAE沉默前后癌細(xì)胞功能學(xué)變化，為闡明YWHAE基因與胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌MGC803細(xì)胞系購自中國生物典型保藏中心；RPMI1640培養(yǎng)基，PVDF膜、聚丙烯酰胺為博士得產(chǎn)品；Gibco?胎牛血清購Thermofisher公司。YWHAE shRNA設(shè)計(jì)、GV248載體連接及慢病毒包裝由上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司完成，靶向的YWHAE基因序列為CTGAGTGAAGAAAGCTATA；YWHAE單克隆抗體、山羊抗鼠二抗均購自abcam公司，GAPDH單抗為博士得產(chǎn)品。Trizol試劑盒、RT-PCR相關(guān)試劑盒(FastQuant RT Kit(With gDNase)，2×Taq Plus PCR MasterMix)為北京天根生物有限公司產(chǎn)品。蛋白裂解液、蛋白marker及BCA蛋白定量試劑盒為杭州碧云天產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細(xì)胞孵育在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)。將處于對(duì)數(shù)生長期的MGC803細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞。在細(xì)胞融合度30%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染步驟按吉?jiǎng)P基因提供的說明書進(jìn)行。簡而言之，實(shí)驗(yàn)分為三組：未轉(zhuǎn)染組、對(duì)照組、shRNA-YWHAE干擾組(干擾組)。去除舊培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2遍，將慢病毒包裝的shRNA-YWHAE及其對(duì)照病毒與無血清及抗生素的培養(yǎng)基混合后分別加入6孔板各孔內(nèi)孵育胃癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后觀察轉(zhuǎn)染效率，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)收取細(xì)胞進(jìn)行下一步干擾抑制效率及功能試驗(yàn)檢測。

1.2.2 RT-PCR檢測提取各組細(xì)胞總RNA，提取方法參照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行操作；Primer 6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)YWHAE、GAPDH mRNA引物，mRNA序列從NCBI網(wǎng)站中獲取，按軟件評(píng)分選取最佳引物引物由上海生工公司合成。YWHAE上游引物：5'-TGCGGAGAACAGCCTAGTG-3'，下游引物：5'-CCTAAGCGAATAGGATGCGTT-3'；GAPDH(內(nèi)參)上游引物：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)按FastQuant RT Kit(With gDNase)，2×Taq Plus PCR MasterMix試劑盒說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)反應(yīng)95℃2 min，變性30 s，60℃30 s，72℃延伸45 s，25個(gè)循環(huán)，循環(huán)終止后72℃延伸5min。將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、拍照、Tanon 5 000凝膠成像分析軟件灰度掃描。

1.2.3 Western blot檢測收集各組細(xì)胞，RIPA裂解細(xì)胞、溶解蛋白，BCA法定量。每個(gè)樣品上樣30 μg，12%聚丙烯酰胺膠電泳分離。4℃下轉(zhuǎn)移固定蛋白于PVDF膜上，5%脫脂奶粉25℃下封閉2 h，轉(zhuǎn)移膜至一抗孵育盒內(nèi)，YWHAE(1:500)、GAPDH(內(nèi)參)一抗(1:1 000)4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌3遍，加入二抗(1:4 000)25℃下孵育1.5 h，TBST洗滌3遍，增強(qiáng)型ECL底物顯色，Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像并分析其光密度。

1.2.4 MTT檢測將各組細(xì)胞消化、吹打，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度2×103/mL，每孔100 μL接種于96孔板，置37℃，5%CO2恒溫箱中孵育，待貼壁0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后每孔加入200 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心，小心吸掉上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570處測量各孔的吸光值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.5 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)將各組細(xì)胞消化、吹打、奇數(shù)，按每組800個(gè)細(xì)胞種植于6孔板中，每組三復(fù)孔，繼續(xù)置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每隔3 d換新鮮培養(yǎng)液一次，15 d后或控制組大多數(shù)克隆細(xì)胞數(shù)大于50時(shí)終止培養(yǎng)，PBS洗滌2次、多聚甲醛固定、GIEMSA染色、拍照、計(jì)克隆數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞周期及凋亡檢測將各組癌細(xì)胞消化、吹打、PBS重懸，清洗2遍，去上清，預(yù)備細(xì)胞周期檢測的細(xì)胞重懸于70%酒精中，4℃過夜，PI染色；預(yù)備細(xì)胞凋亡檢測的細(xì)胞1×binding buffer洗滌細(xì)胞沉淀一次，1×staining buffer重懸細(xì)胞沉淀，采用Annexin V-APC染色；FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組內(nèi)比較均采用配對(duì)Student's t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YWHAE干擾效率檢測本研究針對(duì)YWHAE基因設(shè)計(jì)了2對(duì)shRNA，連接GV248慢病毒質(zhì)粒，慢病毒包裝后感染胃癌細(xì)胞MGC803。轉(zhuǎn)染48 h后觀察轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)95%以上癌細(xì)胞出現(xiàn)熒光，表明感染效率在95%以上，滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求(圖1)。隨即，應(yīng)用RT-PCR、Western blot驗(yàn)證YWHAE在基因及蛋白水平上的敲除效率。結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，干擾組1#、2#mRNA及蛋白表達(dá)率分別下降72.7%、53.6%及71.5%、55.2%(圖2)，表明2對(duì)YWHAE-shRNA均明顯抑制YWHAE基因的表達(dá)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。據(jù)此，本研究選擇干擾組1#進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后白光及熒光圖(×200)

圖2 慢病毒介導(dǎo)YWHAE-shRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MGC803沉默效率檢測

2.2 YWHAE表達(dá)沉默對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞生長的影響為進(jìn)一步觀察YWHAE表達(dá)沉默對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803生長的影響，MTT檢測被應(yīng)用去觀察轉(zhuǎn)染YWHAE-shRNA前后MGC803細(xì)胞生長速度的變化。結(jié)果顯示，干擾組細(xì)胞的生長速度明顯低于對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性抑制，24 h、48 h、72 h抑制效率分別為18.9%，27.3%，44.5%(圖3)，干擾組細(xì)胞增長速率明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，72 h增長倍數(shù)分別為1.56、2.43，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，未轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明YWHAE表達(dá)沉默能抑制胃癌細(xì)胞MGC803的生長。

2.3 YWHAE表達(dá)沉默對(duì)胃癌細(xì)胞克隆形成的影響克隆性生長是癌細(xì)胞生長的一大特點(diǎn)，為探討YWHAE表達(dá)沉默是否干擾腫瘤細(xì)胞的克隆形成，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)被應(yīng)用。結(jié)果顯示，抑制YWHAE基因表達(dá)后，癌細(xì)胞克隆形成率明顯降低，干擾組、對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組克隆形成率分別是6.24%、31.00%、31.95%，干擾組是對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組克隆形成率的20.13%及19.53%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，兩個(gè)控制組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明沉默YWHAE的表達(dá)能顯著降低癌細(xì)胞腫瘤克隆形成率(圖4)。

圖3 YWHAE表達(dá)沉默對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803細(xì)胞生長的影響(MTT檢測法)

2.4 YWHAE表達(dá)沉默對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響為分析YWHAE表達(dá)沉默抑制胃癌細(xì)胞MGC803生長的原因，流式細(xì)胞術(shù)被應(yīng)用去檢測YWHAE基因表達(dá)沉默前后細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化。分析顯示，YWHAE表達(dá)沉默后，細(xì)胞凋亡率明顯增加，干擾組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后3 d平均細(xì)胞凋亡率為9.83%，而對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞平均凋亡率分別為3.23%、2.90%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖5。

YWHAE表達(dá)沉默后，干擾組細(xì)胞處于細(xì)胞周期G1期者為72.4%，而對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別為57.9%及56.4%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明YWHAE在胃癌MGC803細(xì)胞中表達(dá)沉默能捕獲細(xì)胞周期在G1期(圖6、表1)。

圖4 細(xì)胞克隆形成圖

圖5 轉(zhuǎn)染YWHAE-shRNA后，各組細(xì)胞凋亡數(shù)量統(tǒng)計(jì)流式圖

圖6 轉(zhuǎn)染YWHAE-shRNA后，各組細(xì)胞周期分布流式圖

表1 轉(zhuǎn)染YWHAE-shRNA后各組細(xì)胞周期變化比較()

表1 轉(zhuǎn)染YWHAE-shRNA后各組細(xì)胞周期變化比較()

3 討論

14-3-3家族基因定位于染色體17p13.3，其編碼蛋白由蘇氨酸及絲氨酸結(jié)合蛋白組成的7個(gè)亞基構(gòu)成，在真核生物中普遍存在表達(dá)[4-5]。14-3-3蛋白具有多種生物活性功能，參與細(xì)胞凋亡、生長代謝調(diào)控、細(xì)胞周期及磷酸化依賴方式蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程等多種細(xì)胞生理活動(dòng)[4-5]。近年來，發(fā)現(xiàn)多種腫瘤存在14-3-3蛋白異常表達(dá)，可能通過激活Ras-Raf及AKT/mTOR等多條信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5，14-15]。

YWHAE是14-3-3家族中的重要成員之一，在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)增高，包括肝癌[6，16]、胃癌[8]、腸癌[7]，腎癌[9]等。研究發(fā)現(xiàn)，YWHAE在正常肝組織內(nèi)表達(dá)缺失或弱表達(dá)，在肝癌組織內(nèi)高表達(dá)，與癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，過表達(dá)YWHAE的肝癌患者預(yù)后不良[6，16]。Liang等[9]和Wang等[17]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的YWAHE與腎癌、結(jié)腸癌的預(yù)后不良相關(guān)。這些研究表明YWHAE在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能扮演著癌基因的角色。

在胃癌組織中，Yan等[8]認(rèn)為，YWHAE存在高表達(dá)，與胃癌的分期及轉(zhuǎn)移相關(guān)；抑制YWHAE表達(dá)，能降低胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞生長速度，捕獲細(xì)胞周期在G1期，認(rèn)為YWHAE在胃癌中是一個(gè)促癌基因。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中存在YWHAE基因低表達(dá)，沉默YWHAE表達(dá)，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移[12]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)腸癌組織中，YWHAE存在過表達(dá)，與腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。為進(jìn)一步驗(yàn)證YWHAE基因表達(dá)與胃癌的關(guān)系，本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默胃癌MGC803細(xì)胞YWHAE表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞生長速度呈時(shí)間依賴性降低，72 h抑制率為44.5%；克隆形成能力同樣出現(xiàn)顯著性降低，干擾組癌細(xì)胞克隆形成率是對(duì)照組的19.53%。表明沉默YWHAE基因表達(dá)能夠降低胃癌細(xì)胞的生長，支持了Yan等[8]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

目前研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌[7，17]、肝癌[6，16]、胃癌[8]和腎癌[9]等惡性腫瘤中，沉默YWHAE表達(dá)能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯，從而抑制癌細(xì)胞生長。其機(jī)制可能是抑制14-3-3ε表達(dá)與減少胞內(nèi)線粒體、降低cyclinE、c-myc表達(dá)相關(guān)。本項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)，YWHAE表達(dá)沉默后，胃癌細(xì)胞MGC803凋亡率增加，細(xì)胞周期捕獲在G1期，提示YWHAE可能通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞G1周期阻滯的方式抑制胃癌細(xì)胞的生長。

綜上所述，沉默YWHAE的表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞的生長，其機(jī)制可能與癌細(xì)胞G1周期捕獲及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)，表明YWHAE的過表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。

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Silencing of YWHAE expression suppresses the proliferation ability of gastric cancer MGC803 cells.

HUANG You-sheng,XIE Na,ZHANG Yi-xin,SUN Fang-jiao,LUO Zhi-fei,XUE Feng-gui.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of YWHAE expression silencing on the proliferation of gastric cancer cells.MethodsThe expression vector of short hairpin RNA(shRNA)sequences for YWHAE(interference group)and the control vector(control group)were constructed,which were used to infect the gastric cancer cells MGC803 after they were produced and packaged by lentiviruses.The expression levels of YWHAE were assayed by Western blot and RT-PCR.Proliferation was evaluated by MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)colorimetric assay.Colony formation analysis was used to determine growth properties of transduced cells. Cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry.ResultsLentivirus-mediated shRNA-YWHAE was successfully transfected into gastric cancer cells.Compared with the control group,the expression of YWHAE was significantly decreased by 72.7%in the interference group by Western blot,RT-PCR analysis.The results of MTT showed that the proliferation ability of the interference group cells was significantly slower than that of the control group,and the cell growth times were 1.56 and 2.43 for 72 h,respectively(P＜0.01).Cell cloning experiment results showed that the clone formation rate of the interference group was 6.24%,which was significantly lower than 31.00%of the control group(P＜0.01).Flow cytometry showed that reduced YWHAE expression in gastric cancer cells lead to the increasing of cell apoptosis rate(from 3.23%to 9.83%),and the difference was statistically significant(P＜0.01).Compared with the control group(57.88%),the proportion of the interference group cells(72.42%)in G1phase increased significantly(P＜0.01). ConclusionThe expression silencing of YWHAE inhibits the proliferation ability of gastric cancer MGC803 cells, which may be associated with cell apoptosis promotion and cell cycle G1arrest.

YWHAE;Gastric cancer;RNAinterference(RNAi);Proliferation;Apoptosis

R735.2

A

1003—6350（2017）16—2581—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.16.001

2017-04-01)

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81260321)

黃幼生。E-mail：hys768811@yahoo.com.cn