新型TRK激酶小分子抑制劑的篩選與驗(yàn)證

王 田，吳燕華

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438； 2.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司生物部，上海 200131)

原肌球蛋白相關(guān)激酶(Tropomyosin-Related Kinase, TRK)是一類神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體.其家族由高度同源性的TRK-A、TRK-B和TRK-C激酶組成，分別由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因編碼[1].TRK激酶與神經(jīng)生長(zhǎng)因子配體結(jié)合后，通過(guò)二聚化及自身磷酸化被激活，進(jìn)而激活下游的信號(hào)分子.已有研究顯示TRK激酶介導(dǎo)的信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡等功能密切相關(guān)[2].近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，TRK激酶在多種惡性腫瘤中經(jīng)過(guò)多種機(jī)制被激活，主要是結(jié)構(gòu)重排和表達(dá)改變.例如，NTRKs與其他的基因重排產(chǎn)生嵌合癌基因，導(dǎo)致TRK激酶在結(jié)構(gòu)上和表達(dá)上發(fā)生改變，不再受到神經(jīng)生長(zhǎng)因子配體的調(diào)節(jié)和控制，發(fā)生組成型突變，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[3].

蛋白激酶都擁有一個(gè)高度保守的催化核心區(qū)域——與ATP結(jié)合的催化裂口(catalytic cleft)，常位于N末端區(qū)域和C末端區(qū)域之間[4].它由多個(gè)亞基折疊形成一個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)，ATP的腺嘌呤環(huán)通過(guò)氫鍵與鉸鏈區(qū)域結(jié)合，核糖具有高疏水性，磷酸基則極易變曲變形，是親水且與溶劑結(jié)合的區(qū)域[5].當(dāng)下，TRK激酶小分子抑制劑的設(shè)計(jì)思路大部分是通過(guò)模仿ATP的結(jié)構(gòu)，篩選與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合激酶催化區(qū)域位點(diǎn)的小分子化合物，抑制TRK激酶酪氨酸殘基的磷酸化，從而阻斷下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移等，發(fā)揮抗腫瘤的功效[6-7].

2018年11月，TRK激酶抑制劑LOXO-101獲批上市，另一個(gè)很有潛力的抑制劑Entrectinib也已經(jīng)向美國(guó)FDA提交上市申請(qǐng).這兩個(gè)藥物在臨床實(shí)驗(yàn)中主要用于NTRK基因融合、ALK及ROS1基因突變的腫瘤患者進(jìn)行干預(yù)和治療，效果顯著[8-9].例如，NTRK基因融合(SQSTM1-NTRK1)的非小細(xì)胞肺癌患者服用Entrectinib藥物26天后，實(shí)體瘤縮小了47%，服用155天后，腫瘤大小縮小了77%，并且病人的呼吸功能得到了明顯的改善[10].LOXO-101對(duì)17種NTRK融合的腫瘤患者有積極的治療效果，有效率高達(dá)76%，其中12%的患者的腫瘤完全消失[11-12].本研究從已知的化合物庫(kù)中發(fā)掘出對(duì)TRK激酶有潛在作用的抑制劑，探索“老藥新用”的可能性.這些抑制劑的研究相對(duì)比較成熟，大多數(shù)已進(jìn)入臨床研究階段，少數(shù)已經(jīng)批準(zhǔn)上市.上市藥物的藥物代謝和安全性資料都較為詳盡，如果發(fā)現(xiàn)這些藥物的新用途，則較快的就可以進(jìn)入臨床評(píng)估，大大縮短了開發(fā)周期，實(shí)現(xiàn)資源的最大化利用.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

TRK-A/B/C激酶、IMDM培養(yǎng)基及胰蛋白酶購(gòu)自Thermo Fisher公司；小分子化合物庫(kù)及陽(yáng)性化合物Entrectinib購(gòu)自上海藍(lán)木化工有限公司；HTRF激酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Cisbio公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；CellTiter-Glo試劑盒購(gòu)自Promega公司.

1.1.2 細(xì)胞

人結(jié)腸癌KM12細(xì)胞，購(gòu)自日本JCRB細(xì)胞庫(kù)；人肺癌NCI-H1975細(xì)胞，購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù).

1.1.3 儀器

Envision 2104多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自Perkin Elmer公司；Echo-555液體工作站購(gòu)自Labcyte公司；Bravo液體工作站購(gòu)自Agilent公司；Vi-cell細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自Beckman公司；IncuCyte購(gòu)自Essen公司.

1.2 方法

1.2.1 HTRF(Homogeneous Time Resolved Fluorescence)方法初篩化合物

1.2.2 初篩小分子化合物的IC50值測(cè)定

利用Echo儀器將化合物進(jìn)行3倍梯度稀釋，制備得到10000，3333，1111，370，123，41，13.7，4.57，1.52，0.51nmol/L和0.17nmol/L各終濃度.按照初篩方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用XLfit軟件(IDBS公司)4參數(shù)(bottom，top，IC50，hill slope)模型計(jì)算化合物IC50值.

1.2.3 抑制劑類型的研究

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)KM12細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞，以0.25%胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng).

1.2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

KM12細(xì)胞均勻吹散，制備成細(xì)胞懸液，用Vi-cell計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，將細(xì)胞按照3000/孔、2000/孔、1500/孔、1000/孔、800/孔、600/孔、500/孔、400/孔、300/孔、200/孔和100/孔的密度接種至384孔板.將細(xì)胞板放在Incucyte儀器中連續(xù)培養(yǎng)一周，設(shè)置為每隔6h讀板1次.

1.2.6 化合物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KM12細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/mL，接種50μL至384孔板中，1000/孔.利用Bravo儀器將化合物稀釋至終濃度為10000，3333，1111，370，123，41，13.7，4.57，1.52，0.51nmol/L，對(duì)照組為等體積的DMSO，于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱72h.隨后加入30μL CellTiter-Glo試劑，培養(yǎng)10min，Envision多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)[15].聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)中，將化合物Crizotinib橫向稀釋至終濃度20000，6667，2222，741，247，82.3，27.4，9.1，3.0，1.0nmol/L，將化合物Entrectinib縱向稀釋至終濃度20，10，5，2.5，1.25，0.625nmol/L.充分混合后加入到細(xì)胞中進(jìn)行增殖抑制效果的分析[16].

2 結(jié) 果

2.1 TRK激酶小分子抑制劑候選化合物的篩選與機(jī)制分析

為了快速獲得潛在的TRK激酶抑制劑，我們首先利用HTRF方法進(jìn)行TRK-A/B/C激酶抑制劑的初步篩選.HTRF是均相時(shí)間分辨熒光技術(shù)的簡(jiǎn)稱，對(duì)時(shí)間分辨熒光(TR-FRET)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提高了靈敏度和穩(wěn)定性.它的發(fā)射波長(zhǎng)為665nm和615nm，能夠很好的避免化合物本身自發(fā)熒光對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾[17].本研究的TRK激酶反應(yīng)均在“穩(wěn)態(tài)”中進(jìn)行，該條件下化合物對(duì)激酶的抑制作用更為敏感.同時(shí)，用已知的TRK抑制劑Entrectinib作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照.以化合物濃度為10μmol/L時(shí)抑制率大于50%為篩選標(biāo)準(zhǔn)，初步獲得了26個(gè)化合物.

注： 各抑制劑均為ATP競(jìng)爭(zhēng)性.

為了進(jìn)一步確定化合物的抑制作用，我們對(duì)初篩陽(yáng)性化合物進(jìn)行了IC50的測(cè)定，結(jié)果如表1所示.除了陽(yáng)性對(duì)照Entrectinib，IC50值(TRK-A)小于20nmol/L的化合物共計(jì)7個(gè)，包括已有相關(guān)報(bào)道的Crizotinib和6個(gè)新穎的化合物.其中，LY2874455是3種TRK激酶的全抑制劑，且抑制作用與陽(yáng)性化合物Entrectinib相當(dāng).GSK-2256098和Dovitinib對(duì)3種TRK激酶的抑制作用也都強(qiáng)于Crizotinib.

我們進(jìn)一步選擇了對(duì)TRK-A激酶的IC50小于10nmol/L的5個(gè)化合物(Crizotinib、Dovitinib、GSK-2256098、LY2874455和AZD4547)的作用機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果如表2所示.利用GraphPad Prism 5軟件mix mode inhibition模式分析化合物的作用機(jī)制，與Crizotinib一樣，4個(gè)新穎的化合物也均屬于ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，α值遠(yuǎn)大于10，且該模式計(jì)算出的Ki值與篩選測(cè)試的IC50結(jié)果一致.

圖1 化合物Dovitinib對(duì)TRK-A激酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線Fig.1 Pattern of ATP competitive inhibitor Dovitinib tested against TRK-A

2.2 TRK激酶候選化合物能夠抑制KM12細(xì)胞的增殖

結(jié)腸癌KM12細(xì)胞是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)存在NTRK基因融合的腫瘤細(xì)胞.它在1號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的原肌球蛋白-3基因TPM3與NTRK1發(fā)生了基因片段重排，異常表達(dá)TPM3-TRK-A嵌合蛋白[18].因此，我們進(jìn)一步用篩選出的TRK激酶抑制劑處理KM12細(xì)胞，在細(xì)胞水平進(jìn)一步篩選能夠抑制KM12細(xì)胞增殖的有效抑制劑.為評(píng)估候選化合物的特異性，我們同時(shí)選擇了NTRK基因正常表達(dá)的人肺癌NCI-H1975細(xì)胞作為對(duì)照.

將化合物作用于細(xì)胞72h，然后用CellTiter-Glo方法進(jìn)行細(xì)胞增殖速率的檢測(cè).如表3所示，在生化水平中篩選出的6個(gè)新穎的化合物對(duì)KM12細(xì)胞的增殖也有顯著的抑制作用，其IC50值均小于0.5μmol/L.其中，LY2874455的抑制作用最為顯著，IC50為26nmol/L，抑制效果接近陽(yáng)性化合物Entrectinib.鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨著化合物濃度的增加和藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，KM12細(xì)胞大量死亡，細(xì)胞數(shù)量明顯減少.化合物對(duì)陰性對(duì)照NCI-H1975細(xì)胞的抑制作用不明顯，LY2874455對(duì)NCI-H1975細(xì)胞的IC50值為676.5nmol/L，與KM12細(xì)胞相比，約有30倍的選擇性.其余化合物IC50值均大于3000nmol/L，與陽(yáng)性化合物Entrectinib相當(dāng)，提示這些化合物都具有較高的靶細(xì)胞選擇性.

2.3 Crizotinib和Entrectinib聯(lián)合用藥可增強(qiáng)Entrectinib對(duì)KM12細(xì)胞增殖的抑制作用

在臨床試驗(yàn)中，Crizotinib對(duì)NTRK基因融合型的腫瘤患者具有抑制腫瘤生長(zhǎng)，腫塊加速變小等顯著的治療效果，但是由于藥物劑量太大，病人出現(xiàn)了胸痛、水腫等一系列的不適應(yīng)癥.患者停止服用Crizotinib，更換服用Entrectinib藥物后，水腫等不適癥逐漸消失并且患者的腫瘤能夠繼續(xù)變小[19].這一現(xiàn)象提示了Crizotinib和Entrectinib聯(lián)合用藥的潛在效果.為了驗(yàn)證這一猜想，我們將兩個(gè)藥物同時(shí)作用于NTRK基因融合型的KM12細(xì)胞，運(yùn)用Combenifit和Calcusyn軟件分析兩種化合物聯(lián)用對(duì)細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用.Crizotinib和Entrectinib聯(lián)合作用于KM12細(xì)胞72h后，細(xì)胞的存活率見(jiàn)圖2(a)(見(jiàn)第180頁(yè))，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率(η細(xì)胞)顯著下降.在圖2(b)、(c)中，Crizotinib在27.4nmol/L和82.3nmol/L兩個(gè)濃度下與Entrectinib的聯(lián)用效應(yīng)數(shù)值大于0，提示兩者在該濃度下協(xié)同作用較為顯著.進(jìn)一步運(yùn)用Calcusyn軟件分析兩藥聯(lián)合的協(xié)同作用，如圖2(d)所示，兩者聯(lián)用的CI(Combination Index)值，Crizotinib在9.14nmol/L、27.4nmol/L、82.3nmol/L和247nmol/L的濃度條件下，與Entrectinib聯(lián)用均具有協(xié)同作用，在27.4nmol/L和82.3nmol/L兩個(gè)濃度下效果比較明顯，尤其在Entrectinib為1.25nmol/L和0.63nmol/L的濃度時(shí)，CI值小于0.5，協(xié)同作用很顯著，且Crizotinib和Entrectinib的濃度都較低，細(xì)胞毒性較弱.

圖2 Crizotinib與Entrectinib聯(lián)用對(duì)KM12細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Combination of Crizotinib and Entrectinib inhibit KM12 cell proliferation

3 討 論

本研究中，分別利用TRK-A/B/C激酶的生化篩選平臺(tái)和TPM3-NTRK1基因融合KM12細(xì)胞的細(xì)胞篩選平臺(tái)，以Entrectinib為陽(yáng)性對(duì)照，篩選得到了Crizotinib及6個(gè)新穎的小分子抑制劑.在TRK激酶生化篩選平臺(tái)中，我們選擇了HTRF檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)，能夠有效的避免化合物熒光吸收和自發(fā)熒光對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，大大減少了假陽(yáng)性或假陰性化合物的風(fēng)險(xiǎn).在激酶反應(yīng)條件中，TRK-A/B/C激酶用量都很低，均小于1nmol/L，大大的提高了化合物的檢測(cè)限度.篩選出的新穎的小分子抑制劑都是酪氨酸激酶抑制劑，如Crizotinib是間變性淋巴瘤激酶(Anaplastic Lymphoma Kinase, ALK)抑制劑；VS-6063和GSK-2256098是局部粘著斑激酶(Focal Adhesion Kinase, FAK)抑制劑；Dovitinib、AZD4547和BIBF1120均是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(Fibroblast Growth Factor Receptor, FGFR)、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β(Platelet-Derived Growth Factor Receptor beta, PDGFRβ)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor, VEGFR)抑制劑；LY2874455是FGFR1/2/3/4的全抑制劑，本研究中發(fā)現(xiàn)其在生化和細(xì)胞水平都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，且與Entrectinib效果相當(dāng)[20].已有研究揭示一個(gè)激酶抑制劑可能同時(shí)抑制兩個(gè)或兩個(gè)以上的激酶，并表現(xiàn)出協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的可能性[4].

在臨床試驗(yàn)中，ETV6-NTRK3基因融合型的乳腺癌患者先服用Crizotinib藥物3周后，腫瘤減小了3%；服用Crizotinib藥物10周后，腫瘤減小了19%；而18周后，患者出現(xiàn)了胸痛、水腫等一系列的不適應(yīng)癥.患者停止服用Crizotinib，更換服用Entrectinib藥物4周后，水腫等不適癥基本消失；服用Entrectinib藥物13周開始，患者的腫瘤開始退化變??；21周后，腫瘤減小了89%[19].在體外細(xì)胞水平上，Crizotinib與Entrectinib聯(lián)合作用于KM12細(xì)胞，結(jié)果表明兩藥聯(lián)用具有協(xié)同抑制KM12細(xì)胞增殖的效果.這個(gè)結(jié)果為進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中兩藥聯(lián)用打下了基礎(chǔ)，同時(shí)為Entrectinib與其他抑制劑的聯(lián)用提供了思路.

綜上所述，本研究篩選的小分子抑制劑將為TRK激酶抑制劑的開發(fā)提供更多的選擇，Crizotinib與Entrectinib聯(lián)合效果為后續(xù)的動(dòng)物體內(nèi)藥效以及臨床藥物治療提供一定的依據(jù).