細菌耐藥的外排機制及其抑制劑

孫仲琳，崔 錦，王 銳，穆 青

(1.復旦大學 藥學院，上海 201203; 2.昭通學院，云南 昭通 657000)

抗生素藥物的發(fā)展及其在臨床上的廣泛使用甚至是過度使用，導致細菌對藥物產(chǎn)生了嚴重耐藥性.所謂細菌耐藥性,是指由于某種抗菌藥物的長期或多次使用,使相同濃度的抗菌藥物不能達到預期的殺滅或抑制細菌的效果，需增大濃度才能達到目的.從進化角度講，細菌產(chǎn)生耐藥性有益于菌體本身適應不利環(huán)境而得以生存，是生物進化的結(jié)果；從醫(yī)療的角度來說，耐藥性引起的直接后果是嚴重影響臨床抗菌治療效果，增加患者治療成本；從新藥研發(fā)角度講，細菌耐藥性的產(chǎn)生極大地縮短了新藥應用周期，增大了新藥的研究與開發(fā)成本[1].總之，細菌耐藥性問題嚴重威脅著人類生命健康，已經(jīng)發(fā)展成為全球性的嚴峻問題，研究耐藥性的產(chǎn)生機制，尋求克服細菌耐藥性的有效方法十分迫切.

1 細菌產(chǎn)生耐藥性的機制

細菌耐藥性分為兩種： 一種為特異性耐藥，表現(xiàn)為細菌僅針對某種或某一類的抗生素產(chǎn)生耐藥，另一種為非特異性耐藥，表現(xiàn)為細菌對多種類型抗生素均產(chǎn)生耐藥[1].細菌特異性耐藥的主要機制有： (1) 細菌自身生成保護酶，對抗生素的化學結(jié)構(gòu)進行修飾使其失活；(2) 藥物作用靶點發(fā)生改變，使藥物不能與靶點結(jié)合而失活.細菌非特異性耐藥常表現(xiàn)為多重耐藥，其機制為： (1) 細菌形成生物被膜對自身進行保護；(2) 細菌細胞膜的通透性下降，導致藥物難以進入細菌，使細菌胞內(nèi)藥物減少；(3) 細菌外排泵對藥物的主動外排，藥物排出增加，使細菌胞內(nèi)藥物濃度降低[2].

由細菌外排泵介導的細菌對抗生素的外排作用是細菌多重耐藥的重要機制之一.細菌外排泵是存在于細胞膜上的具有外排功能的蛋白質(zhì)(膜轉(zhuǎn)運蛋白)，能夠?qū)⑦M入胞內(nèi)的抗菌藥物泵出胞外，使菌體內(nèi)藥物濃度降低而導致耐藥[3].這種膜轉(zhuǎn)運蛋白的能量主要來源于兩種： ATP水解釋放的自由能(主要主動轉(zhuǎn)運體)或跨膜質(zhì)子移動產(chǎn)生的驅(qū)動能(次要主動轉(zhuǎn)運體)[4].

自從1980年第一次認識到外排泵機制是導致大腸桿菌耐四環(huán)素的重要原因以來[1]，已有多種細菌外排泵介導的多藥耐藥現(xiàn)象的報道，這種普遍存在于各種細菌中的外排作用與降低膜通透性的機制類似，都可以使細菌胞內(nèi)的藥物濃度降低而產(chǎn)生耐藥[5].

2 主動外排耐藥機制的特點

多藥耐藥主動外排系統(tǒng)是存在于細菌胞膜上的一類蛋白質(zhì)，可以非選擇性的將藥物泵出胞外.從這一作用過程可以總結(jié)到，多藥耐藥主動外排機制具有底物廣泛、外排蛋白多樣、能量依賴和外排泵來源菌多樣等特點.

2.1 底物廣泛

細菌的多藥耐藥外排泵可識別的底物十分廣泛，目前已有報道的可被外排泵排出的底物類別有： 抗生素類藥物，合成類抗菌藥物，表面活性劑類，抗菌染料類，金屬離子類，去污劑類，消毒防腐劑類等[5].這種廣泛的底物識別特性是細菌排除有害物質(zhì)的自我保護機制，也是產(chǎn)生多重耐藥性的重要原因和生物學基礎.

2.2 外排蛋白多樣

介導細菌多重耐藥的主動外排泵本質(zhì)是細胞膜上起轉(zhuǎn)運作用的蛋白質(zhì)，種類豐富.主要分為膜通道蛋白、主要主動轉(zhuǎn)運體、次要主動轉(zhuǎn)運體、組易位體和其他功能不明的轉(zhuǎn)運蛋白5類，其中主動外排耐藥性的轉(zhuǎn)運蛋白屬于次要主動轉(zhuǎn)動體和主要主動轉(zhuǎn)運體兩類[6].而細菌多重耐藥的主動外排泵主要可分為5大家族： ATP結(jié)合盒家族(ATP-Binding Cassette, ABC)；主要易化子超家族(Major Facilitator Superfamily, MFS)；小多重耐藥性家族(Small Multi-drug Resistance, SMR)；耐藥-結(jié)節(jié)化細胞分化家族(Resistance Nodulation cell Division, RND)；多藥及毒性化合物外排家族(Multidrug And Toxic compound Extrusion, MATE)[6].不同的氨基酸序列和多變的三維蛋白結(jié)構(gòu)是形成不同家族外排泵的主要原因.

ABC家族是依靠ATP水解供能的，同時存在于原核生物和真核生物[7].ABC家族的成員都具有相似的4個結(jié)構(gòu)域： 兩個疏水跨膜區(qū)域，通常各由6個跨膜的α螺旋構(gòu)成，它們被兩個親水性的核苷酸結(jié)合區(qū)域分開.兩個核苷酸結(jié)合區(qū)域分布在細菌細胞膜的內(nèi)表面上，是ATP水解的位點.ABC家族多藥外排系統(tǒng)典型代表是與腫瘤耐藥相關的p-糖蛋白，同時也在葡萄球菌屬、屎腸球菌、霍亂弧菌和乳酸乳球菌等細菌中有發(fā)現(xiàn)[8].在細菌外排系統(tǒng)中，ABC家族對外排底物具有高選擇性，如糖，氨基酸，金屬離子，有機鐵復合物，維生素和抗生素等[7].

MFS家族為跨膜質(zhì)子能驅(qū)動型外排系統(tǒng)，可以細分為若干亞家族，其氨基酸序列高度保守，表現(xiàn)為12或14個跨膜蛋白.在MFS的每一類亞家族中，都存在特異性多藥轉(zhuǎn)運蛋白，能介導特異性藥物外排，且革蘭氏陽性菌與陰性菌的外排模式不同[9].金黃葡萄球菌的NorA、QacA，肺炎鏈球菌的PmrA，糞腸球菌的EmeA等外排系統(tǒng)等都屬于MFS家族[10].

SMR家族同為跨膜質(zhì)子能驅(qū)動型外排系統(tǒng)，該家族是已知的最小的外排蛋白系統(tǒng)，僅具有110個氨基酸殘基和4個跨膜區(qū)域，其跨膜區(qū)與MFS家族的跨膜區(qū)無同源性.SMR家族僅存在于細菌中，典型包括金黃葡萄球菌的Smr(QacC)和大腸桿菌的EmrE等.盡管該族外排泵屬于多藥耐藥外排泵，它們作用的底物范圍僅限于親脂性陽離子，包括抗菌劑和消毒劑等[11].

跨膜質(zhì)子能在RND族外排泵的能量驅(qū)動機制中有重要作用.RND家族外排泵廣泛存在于革蘭氏陰性菌中，是導致臨床上陰性菌對多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因.RND族外排泵具有特殊的拓撲結(jié)構(gòu)，由12個跨膜區(qū)域(TMS)及2個大的膜外的環(huán)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，這2個環(huán)狀結(jié)構(gòu)分別位于TMS1和TMS2、TMS7和TMS8之間[10].所有的RND族外排泵都是多藥轉(zhuǎn)運體，相比MFS家族和SMR家族，RND家族外排底物更為廣泛，涵蓋親脂性和兩性分子，包括多種抗生素、防腐劑、染料和洗滌劑等[12].銅綠假單孢菌的MexB，大腸桿菌的AcrB，空腸彎曲桿菌的MexB和淋病奈瑟氏菌的MtrD等外排系統(tǒng)都屬于RND家族[13].

MATE家族與MFS家族的膜拓撲結(jié)構(gòu)相似，但是和MFS家族成員并不存在同源性.并且該家族利用電化學梯度，例如鈉離子或氫離子梯度作為驅(qū)動能量來源[14].副溶血性弧菌的NorM，霍亂弧菌的VcrM，流感嗜血桿菌的HmrM，銅綠假單孢菌的PmpM，艱難梭狀芽胞桿菌的CdeA和金黃葡萄球菌的MepA等外排系統(tǒng)都屬于MATE家族[15].

2.3 能量依賴性

細菌外排泵主導的主動外排過程是需消耗能量的，兩種能量來源為質(zhì)子移動力(PMF)或ATP的分解.據(jù)此，外排系統(tǒng)可分為跨膜質(zhì)子梯度能驅(qū)動型外排泵和ATP水解能驅(qū)動型外排泵兩大類[1].常見的外排蛋白5大家族中SMR家族，MATE家族，MFS家族和RND家族都屬于PMF型，ABC家族為ATP型[15].

2.4 外排泵來源菌多樣

多藥耐藥外排系統(tǒng)來源十分普遍，廣泛分布于革蘭陽性菌(金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、乳酸乳球菌、糞腸球菌)、革蘭陰性菌(大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、腸道沙門氏菌、鮑曼不動桿菌、空腸彎曲桿菌、淋病奈瑟氏菌)、真菌(白色念珠菌)以及結(jié)核桿菌(結(jié)核分枝桿菌、恥垢分支桿菌)中.不同來源菌的外排系統(tǒng)種類各異，可以對不同種抗生素產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，這是導致臨床抗感染治療失敗的主要原因.表1是臨床常見幾種菌的外排系統(tǒng)種類和所屬家族類型.

表1 臨床常見幾種菌的外排系統(tǒng)種類和所屬家族類型

3 細菌多藥耐藥外排泵抑制劑

臨床上克拉維酸與阿莫西林聯(lián)合應用能夠用于治療耐阿莫西林細菌所引起的感染，而克拉維酸的作用機制是抑制β-內(nèi)酰胺酶對β-內(nèi)酰胺類抗生素的水解作用，其中β-內(nèi)酰胺酶是細菌自身產(chǎn)生的一種保護酶.與此類似，許多細菌的另一種自我保護作用是通過外排系統(tǒng)將進入胞內(nèi)的抗菌藥物泵出胞外，從而使胞內(nèi)藥物濃度降低而導致耐藥[3].外排泵抑制劑可以通過抑制外排泵對抗生素的外排作用，從而恢復細菌對抗生素的敏感性，是解決耐藥性問題的可行方法.而且某些外排泵抑制劑在改善某些藥物的動力學特性方面(降低肝、腎清除率，提高口服藥物的吸收)也有作用[4].細菌外排泵抑制劑來源豐富，從天然產(chǎn)物和合成化合物中都可得到，表2是不同來源的外排泵抑制劑類型，代表結(jié)構(gòu)如圖1和圖2所示.

表2 不同來源的外排泵抑制劑類型

圖1 植物來源外排泵抑制劑Fig.1 Efflux pump inhibitors from plants

圖2 生物合成和化學合成來源外排泵抑制劑Fig.2 Efflux pump inhibitors from biosynthesis and chemical synthesis

針對細菌多藥耐藥的跨膜質(zhì)子梯度能驅(qū)動抑制劑的代表藥物為5’-methoxy-hydnocarpin(5’-MHC)，MC-207,110，Piperine及氰氯苯腙.5’-MHC單獨用藥無抗菌活性，但與抗菌藥物聯(lián)合使用時能完全抑制MDR的外排能力[55].MC-207,110為二肽類廣譜外排泵抑制劑，抑制效力與肽無關，只要具有雙陽離子并且脂溶性相似就可以抑制MDR的外排能力[67].氰氯苯腙為質(zhì)子動力解偶聯(lián)劑.另外，有相關報道首個被發(fā)現(xiàn)的P-gp蛋白抑制劑維拉帕米對結(jié)核分支桿菌外排系統(tǒng)具有抑制作用[68].

4 外排泵分子機制舉例

隨著科學的不斷發(fā)展，人們對外排泵的研究已深入到分子基因水平.我們不僅對外排泵的耐藥機理和作用機制有了更加深刻的認識，同時意識到從分子基因水平上可能根本解決困擾人類的細菌耐藥性問題.克隆外排基因，提高阻遏蛋白水平，調(diào)控外排基因的表達；或設計相應的阻斷劑，封閉基因；或采用基因缺失的方法都是可利用的手段，也是亟待解決的問題[69].從分子水平認識細菌耐藥機制，對于解決細菌耐藥性問題至關重要.下面分別以銅綠假單胞桿菌和金黃葡萄球菌為例闡述革蘭陰性菌和陽性菌的外排泵分子機制.

4.1 銅綠假單胞菌外排泵分子機制

銅綠假單胞菌屬于革蘭陰性菌，其外排泵的作用是造成臨床嚴重耐藥的重要原因.銅綠假單胞菌主要有4種外排泵，即MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY，均屬于RND家族.其中MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN外排系統(tǒng)由內(nèi)膜轉(zhuǎn)動蛋白、外膜外排蛋白和膜融合蛋白組成[69].MexXY外排系統(tǒng)缺少外膜外排蛋白基因，可能利用OprM表達產(chǎn)物發(fā)揮外排作用，而位于其上游的MexZ可編碼MexXY表達的阻遏物，阻遏MexXY的表達，可提高對氨基糖苷類等多種抗生素的敏感性[69].如果MexA、MexB或OprM缺失，可使銅綠假單孢菌對多種抗生素敏感度增加.臨床分離得到的銅綠假單胞菌菌株nalB的mexR基因與MexAB-OprM的表達相關，mexR基因可以直接抑制MexAB-OprM和自身的表達，從而減弱細菌對藥物的抵抗能力[70].

4.2 金黃葡萄球菌外排泵分子機制

金黃葡萄球菌有多種類型的外排泵，其中報道較多的是NorA外排系統(tǒng).NorA外排系統(tǒng)屬于MFS家族，外排蛋白由388個氨基酸殘基組成，含12個跨膜結(jié)構(gòu).NorA外排蛋白由位于染色體Sma ID片段上的norA基因編碼.NorA編碼基因norA轉(zhuǎn)錄水平過高或mRNA水平過高導致了該菌耐藥，與NorA蛋白的結(jié)構(gòu)變化無關.norA基因表達的潛在負調(diào)節(jié)因子是norR，norR的過度表達可抑制norA的表達[69].

多藥耐藥外排系統(tǒng)種類繁多，作用機制錯綜復雜，在細菌耐藥性產(chǎn)生過程中發(fā)揮著重要作用，但同時也為我們對抗細菌耐藥提供了可能的途徑，即可以從外排泵蛋白分子水平抑制和基因水平調(diào)控方面來解決這個問題.目前從植物、微生物以及化學合成物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了多種能抑制外排活性的物質(zhì)(圖1和圖2)，因此將抗菌劑與外排泵抑制劑相結(jié)合,可以開發(fā)出更加高效、更為廣譜的抗菌藥物.尤其是天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有多樣性，不易被各種外排系統(tǒng)識別為底物，對細菌生長沒有直接抑制作用，更有利于其協(xié)同現(xiàn)有抗菌劑發(fā)揮抗菌作用.我國擁有豐富的植物資源，這一天然寶庫，作為外排泵抑制劑來源具有重要的研究意義及應用價值.