PTEN基因過表達對BMSCs遷移的影響

汪顯耀 賀麗虹 許鍵煒 盧俊厚 張煥相△ 何志旭，3*

(1.貴州醫(yī)科大學干細胞與組織工程實驗中心，貴州 貴陽 550004；2.蘇州大學干細胞與組織工程實驗室，江蘇 蘇州 215123；3.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004)

間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種來源于中胚層的成體干細胞，廣泛存在于器官間質和結締組織中，以骨髓中含量最為豐富，故又稱為骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)[1-2]。研究[3]表明，BMSCs表現(xiàn)出較高的運動及趨向病灶區(qū)域遷移的能力。然而，成功遷移至損傷或病變部位的細胞數(shù)極少，修復和治療效果非常有限。因此，提高BMSCs的定向遷移能力，增加遷移到損傷或病變部位的移植細胞數(shù)量至關重要。

PTEN基因又稱為腫瘤抑制基因，中文名為人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因，位于10q23，屬于PTP(protein tyrosine phosphatases)基因家族成員，與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關。PTEN基因編碼一種腫瘤抑制因子，通過阻止細胞生長、分裂的速度過快，進而調控細胞分裂周期。研究表明，大部分癌癥患者都有PTEN基因的突變或缺失，包括非小細胞癌[4]、前列腺癌[5-6]、胃癌[7]和結直腸癌[8]等。而在BMSCs中， PTEN基因的研究鮮有報道。本文通過構建Ad-PTEN重組腺病毒載體，并利用293A細胞包裝重組腺病毒。通過體外實驗探究PTEN基因對BMSCs細胞遷移的影響，為深入研究PTEN基因對BMSCs的遷移機制奠定基礎。

1 材料方法

1.1實驗動物 清潔級Sprague Dawley(SD)大鼠，體重約150 g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。本研究動物實驗依照《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《貴州醫(yī)科大學實驗動物管理辦法》實施執(zhí)行。

1.2主要材料及試劑 pAdTrack-CMV質粒和腺病毒骨架質粒pAdEasy-1均由蘇州大學楊吉成教授惠贈。pMD19-T載體購自Takara公 司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，限制性內切酶Kpn I和Xba I，Pac I酶和DNA marker(Takara公司)、質粒抽提試劑盒和Trizol Reagent(Invitrogen公司)、dNTP Mix 和 Taq DNA polymerase酶 (Takara公 司)、瓊脂糖、氨芐青霉素和卡那霉素(Sigma公司)、DNA回收試劑盒(QIAGEN公 司)。QBI-293A細胞由蘇州大學干細胞與組織工程實驗室保存。1640細胞培養(yǎng)基、L-DMEM細胞培養(yǎng)基、雙抗、胰酶均購自Hyclone公司，F(xiàn)BS(BI公司)，RNA逆轉錄試劑盒和定量PCR試劑盒購自Thermo公司。細胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管、凍存管、移液槍頭等均購自Corning公司。

1.3方法

1.3.1BMSCs細胞分離培養(yǎng) SD大鼠，乙醚麻醉，頸椎脫臼處死。全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs，按1∶2比例傳代培養(yǎng)。實驗所用細胞為狀態(tài)良好的第3～10代細胞。

1.3.2cDNA模板的獲得 BMSCs細胞PBS清洗2遍，Trizol法提取RNA，檢測RNA濃度和A260/A280值，通過反轉錄獲得cDNA。-20 ℃保存制備好的cDNA以備用。

1.3.3PCR反應擴增大鼠PTEN基因 查詢NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站，得到大鼠PTEN(NCBI登入號：NM_031606.1)的編碼區(qū)序列。針對PTEN序列設計含有Kpn I和Xba I限制性酶切位點的PCR引物，PTEN-sense：5’ CTGGGTACCATGACAGCCATCATCAAAG 3’，PTEN-antisense：5’GGCTCTAGATCAGACTTTTGTAATTTGTG 3’。劃線部分為酶切位點，分別為Kpn I和Xba I，序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。以1.3.2產(chǎn)物為模板，退火溫度60 ℃進行PCR克隆PTEN，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3.4PCR產(chǎn)物與pMD-T載體的連接 將pMD19-T載體與1.3.3獲得的PCR產(chǎn)物在16 ℃進行連接反應，連接30 min。體系為：PCR產(chǎn)物(1 μL)、pMD19-T載體(2.6 μL)、Solution I(5 μL)、ddH2O(1.4 μL)。連接產(chǎn)物通過鈣轉法轉化至感受態(tài)細胞DH5α中，氨芐青霉素篩選陽性菌落。挑取單菌落搖菌培養(yǎng)，抽提質粒，將提取的質粒進行Kpn I和Xba I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。取鑒定正確的陽性克隆，送上海生工進行測序鑒定。測序得到的結果使用DNAMan軟件進行比對，將比對完全正確的克隆命名為pMD19-T-PTEN，保存菌種并提取質粒以備后續(xù)實驗。

1.3.5Ad-PTEN重組腺病毒載體的構建及鑒定 pMD19-T-PTEN進行Kpn I和Xba I雙酶切后，凝膠回收目的基因片段，使用T4 DNA連接酶與同樣進行Kpn I和Xba I雙酶切處理的pAdTrack-CMV穿梭載體進行連接反應，將連接產(chǎn)物轉化XLB感受態(tài)細胞，挑取陽性單克隆，搖菌培養(yǎng)并提取質粒，進行Kpn I和Xba I雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。腺病毒骨架載體pAdEasy-1轉化至DNA重組活躍的BJ5183菌株中，在Amp+抗性下培養(yǎng)并搖培制備重組感受態(tài)細胞，接著將與穿梭載體連接正確的質粒進行Pme I酶切線性化處理以暴露其同源重組位點，將線性化產(chǎn)物與pAdEasy-1載體在上述制備的重組感受態(tài)細胞中進行同源重組，使用Kan+抗性的LB平板初步篩選重組成功的克隆。利用Pac I酶切鑒定，將重組的載體作PCR，分別1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.6腺病毒包裝 將重組成功腺病毒載體通過Pac I酶切，根據(jù)lipofectamine 2000操作說明轉染QBI-293A細胞進行病毒的包裝。7～10 d后收集感染的QBI-293A細胞，在-80 ℃與室溫間反復凍融3次后，5 000 rpm，離心5 min，將上清液加入新的QBI-293A細胞進行反復感染和擴增獲得高滴度的病毒液，-80 ℃保存。

1.3.7Western blot 細胞感染病毒后48 h， PBS清洗2遍，加入液氮，以200 μL細胞裂解液提取總蛋白，用BCA試劑盒檢測所提蛋白的濃度。將蛋白與4×上樣緩沖液混合，95°C加熱變性10 min，冰上冷卻，分裝，-80 ℃保存，常規(guī)Western blot電泳法檢測蛋白表達情況。

1.3.8劃痕實驗 細胞按照105/mL密度接種6孔板，細胞貼壁后感染病毒，48 h后以黃色槍頭于皿底十字劃線，12 h后倒置顯微鏡下拍照，統(tǒng)計劃痕愈合率。劃痕愈合率=(原始劃痕面積-剩余劃痕面積)/原始劃痕面積×100%。

1.3.9Boyden chamber Boyden chamber下室加入30 μL含2% FBS的細胞培養(yǎng)基，以孔徑8 μm的多聚賴氨酸PLL包被的PVP-free polycarbonate membrane蓋住下室，依次蓋上軟塑片和硬塑片，避免氣泡產(chǎn)生。細胞準備成8×105/mL的單細胞懸液，50 μL的單細胞懸液接種在Boyden chamber的上室，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。細胞刮刀刮去未遷移的細胞，4%多聚甲醛中室溫固定30 min，5%結晶紫中染色15 min，自來水漂洗后于倒置相差顯微鏡下拍照，統(tǒng)計遷移至膜下方的細胞數(shù)。將對照組的遷移細胞數(shù)標準化定義為1。

2 結 果

2.1PTEN基因PCR產(chǎn)物與pMD19-T克隆載體的構建 如圖1 A，凝膠電泳結果顯示在1200 bp處出現(xiàn)目的條帶。將提取的質粒進行Kpn I和Xba I雙酶切，在1200 bp處成功獲得目的片段(圖1 B)。送上海生工進行測序鑒定，測序得到的結果使用DNAMan軟件進行比對，比對結果顯示克隆序列與GenBank中人的序列一致。

2.2Ad-PTEN重組腺病毒載體的構建及鑒定 結果顯示成功切出穿梭載體片段和目的片段(圖2 A)，進行Pme I酶切線性化處理以暴露其同源重組位點(圖2 B)，如圖2 C所示重組質粒經(jīng)Pac I單酶切成功切出約30 Kb的大片段和3 Kb左右的小片段；將重組的載體進行PCR鑒定，結果顯示在相應位置成功擴增出PTEN基因(圖2 D)。

注：圖A為PCR獲得目的產(chǎn)物，M.marker；PTEN：1212 bp。圖B為pMD19-T載體與PTEN連接產(chǎn)物以Kpn I和Xba I雙酶切鑒定，M.marker；1.pMD19-T-PTEN雙酶切產(chǎn)物(片段大小分別為2692 bp和1212 bp)。

圖1PTEN的擴增與TA克隆

注：圖A為pAdTrack-CMV-PTEN以Kpn I和Xba I雙酶切鑒定，M.marker；1.pAdTrack-CMV；2.pAdTrack-CMV-PTEN；3.pAdTrack-CMV-PTEN以Kpn I和Xba I雙酶切產(chǎn)物。圖B為pAdTrack-CMV-PTEN進行Pme I單酶切線性化處理，M.marker；1.pAdTrack-CMV-PTEN以Pme I單酶切產(chǎn)物。圖C為Ad-PTEN同源重組克隆Pac I單酶切鑒定，M.marker；1.Ad-PTEN Pac I酶切鑒定。圖D為Ad-PTEN同源重組克隆PCR鑒定，M.marker；1.Ad-PTEN PCR鑒定產(chǎn)物。

圖2Ad-PTEN重組腺病毒載體的構建

2.3Ad-PTEN腺病毒包裝 見圖3，利用熒光顯微鏡觀察GFP的表達情況以確定轉染效率和包裝的進度。9 d后，收集細胞反復凍融獲得重組病毒子Ad-PTEN，進行多次擴增，產(chǎn)生滴度為5×107Pfu/mL的病毒，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4PTEN基因過表達抑制BMSCs的遷移 Ad-PTEN感染BMSCs 48 h后，PTEN表達相對于對照組顯著上調，見圖4。以Ad、Ad-PTEN感染BMSCs，48 h后十字劃痕，12 h熒光顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并計算劃痕愈合率。見圖5，高表達PTEN基因后，細胞劃痕愈合率為(23.45±2.57)%，而對照組劃痕愈合率為(44.76±2.2)%，說明高表達PTEN基因顯著抑制細胞劃痕愈合率。Boyden chamber檢測顯示，高表達PTEN基因后，細胞相對遷移數(shù)為(0.39±0.03)，說明高表達PTEN基因顯著抑制細胞遷移，見圖6。

注：以Ad、Ad-PTEN感染MSCs，48 h后提取總蛋白，Western blot檢測PTEN的表達。以β-actin為內參，將MSCs感染Ad后PTEN的相對表達量標準化為1，與Ad相比，*P<0.05。

圖4Western blot檢測MSCs感染Ad-PTEN后PTEN的表達

注：以Ad、Ad-PTEN感染BMSCs，48 h后按照之前Boyden chamber方法進行實驗。

圖6Boyden chamber檢測BMSCs感染Ad-PTEN后細胞遷移能力變化

3 討 論

間充質干細胞(MSCs)是一種中胚層來源的多能成體干細胞。具有容易擴增，低免疫原性等特點，成為干細胞治療和組織再生的理想種子細胞。之前研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能明顯改善脊髓損傷膠質瘢痕的形成[9]，能顯著提高放射性皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合率等[10]。 MSCs向病變部位的遷移是細胞移植治療的關鍵，但在體內研究中發(fā)現(xiàn)只有少量的移植細胞遷移到損傷或病變部位，修復和治療效果十分有限[11-12]。因此，如何提高MSCs的遷移能力，增加遷移到損傷或病變部位的移植細胞數(shù)量是改善療效的關鍵。

PTEN基因又稱為腫瘤抑制基因，與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關[13-14]。PTEN的脂質磷酸酶活性導致PIP3去磷酸化生成PIP2，導致PI3K對Akt的磷酸化作用被阻斷，負調控PI3K/Akt信號通路[15]。在癌細胞中，PTEN基因的缺失或突變，主要導致Akt信號的過度活化，這也是癌細胞過去增殖和侵襲的主要原因[16-17]。但是在BMSCs中，對PTEN基因的研究鮮有報道。本文通過構建Ad-PTEN重組腺病毒載體，利用293A細胞成功包裝出高滴度的重組腺病毒。通過Western blot驗證，Ad-PTEN上調BMSCs細胞中PTEN的表達。以Ad-PTEN上調BMSCs細胞中PTEN基因的表達，結果發(fā)現(xiàn)BMSCs的遷移能力明顯受到抑制，表明，PTEN基因高表達顯著抑制BMSCs的遷移。這為BMSCs的遷移機制研究和臨床應用提供了重要線索。

綜上，PTEN基因在BMSCs遷移中起著重要的作用。但是，目前PTEN基因在BMSCs細胞中的生物學功能及其具體作用機制尚未見報道，有待進一步深入研究。