活動性肺結(jié)核患者Tim-3/Galectin-9的表達(dá)變化及其與巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)性

代嬌 宋秋玲 段慧英 王露喬 畢靜

1曲靖醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校（云南曲靖655011）；2昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（昆明650032）

肺結(jié)核（pulmonary tuberculosis，TB）由結(jié)核桿菌引起，是全球范圍內(nèi)最致命的感染性疾病之一。據(jù)報道每年有927萬新發(fā)TB病例，且其中410萬病例涂片陽性［1］。長期的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)僅5%～10%的結(jié)核桿菌感染者進(jìn)展為活動期狀態(tài)，這也表明人體免疫系統(tǒng)可以影響結(jié)核桿菌的復(fù)制，并在大部分人群中可以阻止疾病進(jìn)展為活動狀態(tài)［2］。而活動期患者通常存在自身免疫系統(tǒng)功能不足的情況，巨噬細(xì)胞通過為結(jié)核桿菌提供胞內(nèi)微環(huán)境而在TB病因?qū)W過程中扮演重要角色，當(dāng)巨噬細(xì)胞被適當(dāng)激活，即可直接殺滅結(jié)核桿菌［3］。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3（T cell Ig and mucin domain 3，Tim-3）是一種重要的免疫負(fù)調(diào)控分子，其在自身免疫和腫瘤免疫中均扮演重要角色，在單核-巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和樹狀細(xì)胞表面均有表達(dá)［4-5］。半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal9）是Tim-3配體之一，兩者結(jié)合發(fā)揮免疫調(diào)控效應(yīng)［6］。先前研究表明活動性TB患者巨噬細(xì)胞出現(xiàn)極化現(xiàn)象，即向著具有免疫抑制功能的M2型分化，而分泌促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)機(jī)體免疫防御的M1型巨噬細(xì)胞則處于劣勢［7］?；顒有訲B中這種極化受到何種分子調(diào)控，目前尚未明確。既往研究證實Tim-3能通過抑制Stat1/miR-155作用軸，上調(diào)SOCS1進(jìn)而促進(jìn)IL-10、Arg-1的表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞M2方向的極化［8］。本研究將通過檢測活動期TB外周血可溶性Tim-3（sTim-3）和可溶性Gal-9（sGal-9）水平，以及外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中Tim-3/Gal-9的表達(dá)變化，及其與M1型巨噬細(xì)胞特征因子iNOS和M2型巨噬細(xì)胞特征因子Arg-1的相關(guān)性，以初步分析活動性TB中Tim-3/Gal-9的變化及其與巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取活動性肺結(jié)核患者組（ATB）33例，其中男19例，女14例，平均年齡（39.1±3.9）歲，其中痰涂片發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌患者24例。所有入選病例診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］，具有細(xì)菌學(xué)或病理學(xué)依據(jù)。肺結(jié)核患者排除合并HIV陽性及其他自身免疫性疾病的病例，且治療前均未曾使用過抗結(jié)核藥物或近3個月內(nèi)未使用過免疫抑制或增強(qiáng)藥物，排除肺部真菌感染，合并腫瘤、矽肺及其他臟器嚴(yán)重疾病的患者。選取潛伏期肺結(jié)核患者（LTBI）31例，其中男17例，女14例，平均年齡（40.3±2.4）歲；該組患者結(jié)核菌素試驗清強(qiáng)陽性或近期由陰性轉(zhuǎn)為陽性，但沒有活動性肺結(jié)核疾病的細(xì)菌學(xué)、影像學(xué)和臨床癥狀的人群。另取健康體檢人群30例，其中男18例，女15例，平均年齡（39.5±2.8）歲；該組人群常規(guī)體檢無異常，既往無結(jié)核病史和臨床癥狀，胸部放射學(xué)檢查無異常，結(jié)核菌素試驗陰性，血清抗結(jié)核抗體陰性。ATB患者治療方案如下：異煙肼0.3 g/次，1次/d；利福平0.6 g/次，1次/d；吡嗪酰胺0.75 g/次，2次/d；乙胺丁醇1.0 g/次，1次/d。以上藥物均為口服，治療周期為6個月。

1.2 血液標(biāo)本采集及處理抽取所有研究對象治療前清晨空腹靜脈血8 mL，其中3 mL置于EDTA抗凝管中用于PBMC提??；另5 mL置于干燥管中，4 000 r/min離心10 min分離血清，血清凍存至-80℃冰箱，備用于檢測血清sTim-3、sGal-9、Arg-1和iNOS的濃度。

1.3 試劑Human TIM-3 Quantikine ELISA Kit（美國R&D公司）、Human galectin-9 Quantikine ELISA Kit（美國 R&D公司）、Human Arginase 1 ELISA Kit？（英國abcam公司）和ELISA Kit for Nitric Oxide Synthase，Inducible（NOS）（美國CCC公司）分別用于檢測血清sTim-3、sGal-9、Arg-1和iNOS的水平。所有步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明說操作。

1.4 方法EDTA抗凝全血與等體積PBS混勻，緩緩加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（天津灝洋），密度梯度離心（2 000 r/min離心30 min），收集中間層細(xì)胞即為PBMC。E.Z.N.A.Total RNA Kit II（上海索寶生物）提取PBMC RNA；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TAKARA公司）合成cDNA；SYBR@Premix Ex TaqTMII（日本TAKARA公司）用于Real time qPCR反應(yīng)，所有實驗嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。Real time qPCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，循環(huán)數(shù)為40，60℃退火30 s。選取人β-actin為內(nèi)參，利用2-△△Ct法計算Tim-3 mRNA和Gal-9 mRNA的相對含量。其中△△Ct=（Ct目的基因-Ctβ-actin）TB組-（Ct目的基因-Ctβ-actin）對照組。2-△△Ct指TB組與對照組目的基因表達(dá)變化的倍數(shù)。引物序列如下：人β-actin：5′-AGTTGCGTTACACCCTTTC-3′（上游引物）和5′-CCTT-CACCGTTCCAGTTT-3′（下游引物）；人 Tim-3：5′-ACTCTACCTACATCTGGGACACT-3′（上游引物）和5′-GTAGGTCCCATGGTCATCCAG-3′（下游引物）；人Gal-9：5′-GTCTCCAGGACGGACTTCA-3′（上游引物）和 5′-CACGTACCCTCCATCTTCA-3′（下游引物）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布或近似正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間差異采用獨立樣本t檢驗，3組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用Fisher′s LSD檢驗；Tim-3和Gal-9與Arg-1和iNOS間相關(guān)性行Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清sTim-3、sGal-9、iNOS和Arg-1以及外周血PBMC上Tim-3和Gal-9 mRNA表達(dá)的差異分析3組受試者中血清sTim-3、sGal-9、iNOS、Arg-1以及外周血PBMC上Tim-3和Gal-9 mRNA水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩兩分析比較發(fā)現(xiàn)ATB患者以上指標(biāo)均高于LTBI和健康對照組。除了Tim-3 mRNA在LTBI組和健康對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余指標(biāo)LTBI組中亦均與健康對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組受試者血清sTim-3、sGal-9、iNOS和Arg-1及外周血PBMC上Tim-3和Gal-9 mRNA的表達(dá)差異Tab.1 Comparison of the levels of sTim-3，sGal-9，iNOS，Arg-1，Tim-3 mRNA and Gal-9 mRNA among three groups of participants x±s

2.2 空洞型和非空洞型ATB患者血清sTim-3、sGal-9、iNOS和Arg-1以及外周血PBMC上Tim-3和Gal-9 mRNA表達(dá)的差異分析空洞型ATB患者血清iNOS、Arg-1以及外周血PBMC上Tim-3mRNA水平與非空洞型ATB患者間均具有顯著差異，而血清sTim-3、sGal-9、以及外周血PBMC上Gal-9 mRNA表達(dá)水平間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 空洞型和非空洞型ATB血清sTim-3、sGal-9、iNOS和Arg-1及外周血PBMC上Tim-3和Gal-9 mRNA的表達(dá)差異Tab.2 Comparison of the levels of sTim-3，sGal-9，iNOS，Arg-1，Tim-3 mRNA and Gal-9 mRNA between ATB patients with cavity and patients without cavity x±s

2.3 ATB患者sTim-3、sGal-9、Tim-3 mRNA和Gal-9 mRNA與iNOS和Arg-1水平間的相關(guān)性相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ATB患者sTim-3、Tim-3 mRNA與iNOS均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.333 7、-0.515 1，P＜0.05），而與Arg-1均呈正相關(guān)（r=0.537 9、0.382 5，P＜0.05）；而sGal-9和Gal-9 mRNA與iNOS間均無相關(guān)性，sGal-9與Arg-1間亦無相關(guān)性，僅Gal-9 mRNA與Arg-1間呈正相關(guān)（r=0.485 9，P＜0.05）。見圖1。

2.4 ATB患者治療前后血清sTim-3、sGal-9、iNOS和Arg-1以及外周血PBMC上Tim-3和Gal-9 mRNA表達(dá)的差異分析分析治療前后ATB患者以上指標(biāo)的差異，結(jié)果顯示治療后血清sTim-3、sGal-9、iNOS和Arg-1以及外周血PBMC上Tim-3和Gal-9 mRNA表達(dá)水平較治療前均有顯著變化，除iNOS顯著上調(diào)外，其余指標(biāo)均較治療前顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 ATB患者治療前后血清sTim-3、sGal-9、iNOS和Arg-1以及外周血PBMC上Tim-3和Gal-9 mRNA表達(dá)的差異分析Tab.3 Comparison of the levels of sTim-3，sGal-9，iNOS，Arg-1，Tim-3 mRNA and Gal-9 mRNA in ATB patients before and after treatment x±s

3 討論

圖1 ATB患者sTim-3、sGal-9、Tim-3 mRNA 和 Gal-9 mRNA與iNOS和Arg-1水平間的相關(guān)性Fig.1 The correlations between sTim-3，sGal-9，Tim-3 mRNA or Gal-9 mRNA and iNOS or Arg-1

巨噬細(xì)胞是抵抗結(jié)核分支桿菌進(jìn)入肺部的第一道防線，其與巨噬細(xì)胞間的相互作用是整個致病過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。探究巨噬細(xì)胞在TB患者中的變化及所受調(diào)控的因素對于弄清TB致病機(jī)制非常重要，既往研究報道巨噬細(xì)胞在不同病原微生物刺激后可向著不同方向分化，呈現(xiàn)出極化現(xiàn)象，且分泌表達(dá)生物學(xué)效應(yīng)相反的細(xì)胞因子和酶類物質(zhì)［10］。其中M1型巨噬細(xì)胞與MHC-II分子和共刺激受體CD86上調(diào)相關(guān)，分泌促炎細(xì)胞因子發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞免疫作用［11-12］；而M2型巨噬細(xì)胞與清道夫受體CD163和甘露糖受體CD206上調(diào)相關(guān)，分泌抗炎細(xì)胞因子發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控效應(yīng)［13］。既往研究［14-15］證實在感染性疾病中M1/M2極化參與致病過程，包括結(jié)核桿菌引發(fā)的肺結(jié)核。在肺結(jié)核患者中單核細(xì)胞顯著增加，M1型巨噬細(xì)胞是參與殺滅分支桿菌和宿主抵抗胞內(nèi)菌的重要細(xì)胞，而M2型巨噬細(xì)胞與組織修復(fù)和細(xì)菌殘留密切相關(guān)。

本研究也發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志性物質(zhì)iNOS顯著下降，而M2型巨噬細(xì)胞特征因子Arg-1則顯著上調(diào)，提示ATB患者確實存在M1/M2巨噬細(xì)胞極化現(xiàn)象，這與HUANG等［15］在結(jié)核病患者中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果類似。巨噬細(xì)胞極化被認(rèn)為是TB中維持炎癥反應(yīng)平衡的關(guān)鍵因素，然而是何信號通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，并不清楚。Tim-3/Gal-9是重要的免疫平衡調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的分化，WANG等［16］發(fā)現(xiàn)TB患者CD8+T細(xì)胞表面Tim-3顯著上調(diào)，Tim-3過表達(dá)會減少IFN-γ的分泌，而阻斷Tim-3則可顯著增加IFN-γ的分泌。JAYARAMAN等［17］在體外腹腔巨噬細(xì)胞感染結(jié)核桿菌的實驗中，加入Tim-3信號阻斷蛋白，能激活Caspase-1介導(dǎo)的IL-1β分泌，來抑制結(jié)核桿菌的生長。楊宜等［18］也報道阻斷Tim-3/Gal-9后小鼠肺部肉芽腫病變明顯減輕，荷菌量亦有所下降，且CD4+T細(xì)胞IFN-γ表達(dá)量顯著上調(diào)。這些結(jié)果提示Tim-3/Gal-9在TB致病過程中可能發(fā)揮重要作用。而近期報道發(fā)現(xiàn)除了在T細(xì)胞上表達(dá)并對T細(xì)胞的調(diào)控，Tim-3/Gal-9還在巨噬細(xì)胞表面表達(dá)并可發(fā)揮調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的生物學(xué)效應(yīng)。JIANG等［19］在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)Tim-3可顯著抑制促炎性M1型巨噬細(xì)胞，Tim-3過表達(dá)會通過降低M1型巨噬細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)而抑制腸道炎癥。但在ATB患者中Tim-3/Gal-9信號通路異常表達(dá)是否與同樣異常的M1/M2極化存在關(guān)聯(lián)，尚未見相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn)ATB患者Tim-3/Gal-9血清水平和PBMC mRNA水平均存在顯著上調(diào)現(xiàn)象，而在治療后卻又顯著下降，這也提示Tim-3/Gal-9可能參與了ATB的病因?qū)W過程。這與先前SHIRATORI等［20］在日本ATB人群和張佳等［21］在中國新疆地區(qū)的研究結(jié)果相一致，但本研究不僅僅檢測了Tim-3/Gal-9血清水平，還同時檢測了其PBMC上mRNA水平，更加全面的證實了Tim-3/Gal-9在ATB患者中存在異常高表達(dá)這一現(xiàn)象。此外，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Tim-3/Gal-9，尤其是Tim-3在血清水平和轉(zhuǎn)錄水平均與M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞特征因子均存在顯著相關(guān)性，也提示在ATB患者中其可能參與了巨噬細(xì)胞極化過程。未來研究中，將對ATB小鼠模型給予Tim-3/Gal-9阻斷和過表達(dá)干預(yù)，進(jìn)一步闡明其對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控效應(yīng)和相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制。

綜上，本研究初步發(fā)現(xiàn)ATB患者外周血Tim-3/Gal-9信號通路存在異常表達(dá)，且與異常變化的M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞特征因子iNOS和Arg-1存在顯著相關(guān)性，可能參與了ATB發(fā)病過程。