骨髓干細胞通過多種機制促進缺血再灌注小鼠腎臟修復

邢麗 宋爾霖 賈西貝 馬靜 李冰 高旭

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1腎內(nèi)一科，2泌尿外科（哈爾濱150001）；3哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)二科（哈爾濱150086）；4哈爾濱醫(yī)科大學生物化學與分子學科（哈爾濱150086）

急慢性腎損傷在臨床中具有很高的發(fā)病率，但是目前治療方法相對有限，如果可以促進腎臟固有細胞的增生，可以明確地促進腎臟的修復。近年來，關(guān)于干細胞治療各種疾病特別是血液疾病在臨床中取得了很好的療效。目前已有研究表明不論是混合的骨髓干細胞還是單純的骨髓造血干細胞或骨髓間充質(zhì)干細胞可以促進急性腎損傷的修復。腎損傷模型包括由雷帕霉素、甘油、葉酸、慶大霉素及缺血再灌注而導致腎損傷［1-2］，但具體的機制仍不明確。本實驗即應用尾靜脈注入的方法證實干細胞是否可以促進急性缺血再灌注腎臟損傷的修復及相關(guān)的機制，為干細胞治療急性腎損傷提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物健康雄性BALB/C小鼠，體質(zhì)量20～25 g，月齡6～8周，由哈爾濱醫(yī)科大學實驗室提供。

1.1.2 主要試劑及儀器DMEM/HIGH GLUCOSE（1×）（HyClone賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司），胎牛血清（HyClone賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司），DMSO（AMRESCO，DMSO-Dime Thylsulfoxide，ultra pure grade），Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit（Invitrogen），rat-anti-mouse CD31 14-0311-82（eBioscience），rabbit anti-mouse ki67（SP6）RM-9106-S0（NeoMarkers），OCT Compound 冰凍切片包埋劑（中杉金橋）。

1.2 方法

1.2.1 分組及準備小鼠隨機分為2組，缺血再灌注模型組和干細胞治療組，每組15只，采用雙側(cè)腎動靜脈夾閉28 min或單腎夾閉30 min的方法建立缺血再灌注腎損傷模型，并采取小鼠股骨骨髓提取并體外貼壁培養(yǎng)方法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞并擴增干細胞，為在體內(nèi)更好地追蹤干細胞將干細胞與CMFDA綠色染料孵育，為證實骨髓間充質(zhì)干細胞對腎臟的保護作用，制成單腎缺血再灌注模型后的一天后通過尾靜脈注入的方式將骨髓間充質(zhì)干細胞（106/mL）500 μL注入到小鼠體內(nèi)，在術(shù)后3、5、7 d通過血、腎臟病理及相關(guān)免疫熒光檢測評價腎臟損傷。

1.2.2 干細胞用流式細胞儀鑒定分別用CD73、CD90、CD45標記，取200 μL放入白色EP管中，保證細胞數(shù)為106個，按照不同的組別加入抗體，上機。

1.2.3 腎功的測定分別于不同時間點尾靜脈取血，5 000 r/min離心10 min，取上清液采用VP-Suppwr Sysuem自動生化分析儀檢測腎功。

1.2.4 光鏡檢查腎組織行HE染色，光鏡下觀察腎臟病理變化，對腎小管間質(zhì)損傷進行定量評估，方法如下：將每個視野分為256個小格，如果小格范圍內(nèi)存在腎小管損傷（腎小管變扁平、凋亡、壞死或出現(xiàn)管型）則為1分，每個腎臟取10個視野，取平均值。

1.2.5 免疫熒光冰凍切片厚度4 mm行免疫熒光染色，CD31用于標記小鼠管周毛細血管密度（1∶100，eBioscience），KI 67用于標記增生的細胞（1∶100，NeoMarker），DAPI用于染細胞核（1∶200，Invitrogen，SanDiego，CA，USA）。管周毛細血管的丟失計算方法同HE病理計數(shù)方法，使用OLYMPUS FLOUVIEW FV1000免疫熒光儀拍攝圖片。

1.3 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，Kaplan-Meier方法計算生存率的差異，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定采用貼壁培養(yǎng)方法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，在不斷換液的過程中骨髓造血干細胞被不斷地剔除，取第四代傳代細胞進行相關(guān)細胞鑒定。光鏡下可以觀察到骨髓間充質(zhì)干細胞具有典型的梭形形態(tài)（圖1A），同時免疫熒光染色制作細胞爬片可以觀察到干細胞具有典型的紡錘形、梭形形態(tài)（圖1B），圖1C為流式細胞散點圖，圖1D分別細胞表面分子CD73、CD90及CD45單參數(shù)直方圖，結(jié)果顯示干細胞表達CD73、CD90但不表達CD45（圖1C、D），證實培養(yǎng)的干細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。

2.2 CMFDA染色的骨髓間充質(zhì)干細胞可以被特異招募到腎臟在單腎缺血再灌注模型中，在造模后的24 h后經(jīng)尾動脈注入的方法將通過CMFDA染色的骨髓干細胞注入到模型鼠體內(nèi)。在造模后的3、5、7 d分別處死小鼠，分別第3、5、7天在左側(cè)腎臟隨著時間的延長招募的骨髓干細胞逐漸減少（圖2A-C），第3及5天較同時間點右側(cè)腎臟干細胞數(shù)目明顯增加（P＜0.05）。右側(cè)腎臟在術(shù)后3 d招募的干細胞數(shù)量很少（圖2D）；不同時間點左側(cè)及右側(cè)腎臟招募干細胞數(shù)量隨時間的變化（圖2F）；在術(shù)后第3天招募到脾臟的干細胞（圖2E）。實驗結(jié)果顯示招募到受損腎臟的數(shù)量明顯高于未受損傷的腎臟，表明干細胞的招募是特異性的，并隨時間的延長逐漸減少，干細胞首先招募到內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)。

2.3 骨髓間充質(zhì)干細胞促進腎臟功能的恢復，提高生存率并增加體質(zhì)量為了證實骨髓間充質(zhì)干細胞是否可以促進腎臟功能的恢復，雙側(cè)腎臟動靜脈夾閉28 min的小鼠模型在不同時間點檢測血肌酐及尿素氮來評價腎臟功能，術(shù)后24 h后肌酐及尿素氮較術(shù)前明顯增加，增加約5～6倍，并隨著時間的延長肌酐及尿素氮水平逐漸下降，但至術(shù)后第7天仍未恢復至正常水平（圖3A、B）。在左側(cè)腎臟動靜脈夾閉30 min的單腎模型中，可以看到腎臟功能在術(shù)后24 h雖也有明顯的增高，但與干細胞治療組無明顯的差別，在第2天肌酐及尿素氮明顯下降，與雙腎夾閉模型相似直到術(shù)后第7天仍未恢復至基礎(chǔ)水平。同時在雙側(cè)腎臟夾閉模型中小鼠體質(zhì)量及生存率的變化，在模型組中術(shù)后小鼠的體質(zhì)量明顯下降，隨著時間的延長，體質(zhì)量逐漸恢復但至術(shù)后第7天仍未恢復至術(shù)前，干細胞治療組小鼠體質(zhì)量仍在術(shù)后第1天有明顯的下降，但隨著時間的延長體質(zhì)量較模型組較快的恢復，至術(shù)后第7天體質(zhì)量幾乎恢復至術(shù)前（圖3C），但兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組小鼠至術(shù)后第7天只有50%的生存率（圖3D），而骨髓間充質(zhì)干細胞的治療明顯提高小鼠生存率（P=0.02）。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞光鏡、流式細胞結(jié)果Fig.1 MSCs Phenotype and flowcytometricanalysis

圖2 骨髓間充質(zhì)干細胞在雙側(cè)腎臟及脾臟的分布Fig.2 The numbers of MSCs recruited to kidney and spleen

2.4 骨髓間充質(zhì)干細胞的治療減輕腎臟病理的改變建立左側(cè)腎臟夾閉30 min的單側(cè)腎臟缺血再灌注模型，在術(shù)后24 h注入骨髓間充質(zhì)干細胞，在術(shù)后3、5、7 d處死小鼠，腎臟病理經(jīng)HE染色。急性缺血再灌注腎損傷病理存在明顯的腎小管損傷，病理表現(xiàn)包括腎小管上皮細胞渾濁腫脹，出現(xiàn)水樣或空泡變性，刷狀緣消失，部分腎小管上皮細胞凝固性壞死、脫落，腔內(nèi)可見蛋白管形，并可見間質(zhì)水腫，間質(zhì)內(nèi)可見灶性炎細胞浸潤（圖4）。本實驗顯示在術(shù)后第3、5天干細胞注入明顯減輕腎臟病理損傷（P＜0.05）。

圖3 不同組不同時間腎臟功能、體質(zhì)量及存活率的變化Fig.3 Serum creatinine，BUN，mortality and the body weight in I/R modal during the time

圖4 不同時間點模型組及干細胞治療組腎臟病理HE染色Fig.4 Histological findings tested by HE-stained in two groups at different time

2.5 干細胞注入促進細胞增生并減少管周毛細血管的丟失在術(shù)后3、5、7 d處死小鼠制成冰凍切片，使用KI67染色標記增生細胞，CD31標記管周毛細血管。隨著時間的延長增生細胞數(shù)量逐漸減少（圖5A-H），在術(shù)后第3天干細胞的注入明顯促進細胞再生（P＜0.01）。骨髓間充質(zhì)干細胞明顯減少管周毛細血管丟失（圖5I-P），特別是在術(shù)后第3天明顯減少管周毛細血管丟失（P＜0.01）。

圖5 干細胞促進細胞增生減少管周毛細血管丟失Fig.5 MSCs promote proliferation of cells and attenuate PTC loss

3 討論

急性腎損傷及慢性腎臟病急性加重病死率高達50%。FRIEDENSTEIN等［3］在世界上首次分離培養(yǎng)了骨髓干細胞。目前已有越來越多的文獻報道干細胞的注入成為治療多種疾病的良好方法其中也包括多種急慢性腎臟疾病［4-6］。骨髓干細胞具有多向分化潛能、容易培養(yǎng)、擴增等優(yōu)勢，與胚胎干細胞相比不存在倫理問題。本實驗即應用骨髓間充質(zhì)干細胞觀察其是否可以促進急性腎損傷的修復。

在本實驗中證實培養(yǎng)的干細胞具有典型的梭形形態(tài)，并進一步通過流式細胞儀檢測的方法證實培養(yǎng)的細胞特異性表達CD73、CD90細胞分子標記，證實為骨髓間充質(zhì)干細胞。在體內(nèi)實驗中通過尾靜脈注入的方法注入到模型鼠體內(nèi)，免疫熒光顯示干細胞特異性被招募到受損的腎臟，并隨著損傷的減輕干細胞數(shù)量逐漸減少，而未受損的右側(cè)腎臟干細胞數(shù)量較少，證實招募為特異性。在雙側(cè)腎臟缺血再灌注模型中結(jié)果顯示干細胞注入可以提高小鼠生存率、促進小鼠體質(zhì)量的增加，促進腎臟功能的恢復，進一步腎臟病理結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細胞注入明顯減少腎臟病理的損傷。為進一步研究骨髓間充質(zhì)干細胞促進腎臟修復的機制，本研究將腎臟冰凍切片行KI67及CD31染色，結(jié)果證實骨髓間充質(zhì)干細胞明顯促進細胞增生，并明顯減輕管周毛細血管的丟失。腎臟急性缺血損傷主要導致近端腎小管損傷，但目前有實驗顯示嚴重的急性腎損傷致長期缺血可以導致管周毛細血管的丟失可進一步加重腎小管損傷并促進腎臟纖維化的進展，管周毛細血管丟失進一步導致受傷區(qū)域血流量的減少，使得氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)輸入減少進一步導致慢性缺血，促進腎小管增生及減輕管周毛細血管的丟失都有助于腎臟功能的恢復。本實驗結(jié)果提示骨髓間充質(zhì)干細胞可以通過增加細胞再生及減輕管周毛細血管的丟失促進缺血再灌注腎損傷的修復，為骨髓間充質(zhì)干細胞應用于臨床再次提供了理論依據(jù)。但本實驗也存在一定的不足，檢測指標仍較為單一，且目前有研究證實干細胞注入體內(nèi)長時間可轉(zhuǎn)分化為脂肪細胞［7］，為干細胞治療腎臟病的安全性提出了重要課題，本實驗的研究時間尚短，尚需進一步的實驗證實。