超聲造影在評價地塞米松改善大鼠腎缺血再灌注損傷中的應(yīng)用價值

孫曉穎 鄺斌 羅志建 李明星

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腹部超聲醫(yī)學(xué)科（四川瀘州646000）

腎臟缺血再灌注損傷（renal ischemia reperfusion injury，RIRI）是指腎臟在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流灌注后組織損傷不緩解，甚至加重發(fā)生不可逆損傷的一種病理現(xiàn)象，主要發(fā)生于心血管手術(shù)、腎移植、腎部分切除術(shù)后等手術(shù)過程中，是造成急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的重要原因，具有較高的發(fā)病率和病死率［1］。因此如何早期發(fā)現(xiàn)缺血再灌注引起的腎損傷及監(jiān)測腎功能的變化一直是臨床研究的熱點。地塞米松（dexamethasone，Dexa）是一種強有效的皮質(zhì)類固醇激素，具有強大的抗炎、抗免疫和抗風(fēng)濕作用，既往相關(guān)研究表明其可以減輕RIRI［2-4］，但少有研究報道應(yīng)用超聲造影（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）技術(shù)來評估其對RIRI微循環(huán)的影響。本實驗擬用CEUS分析體外給予地塞米松后，腎皮質(zhì)血流時間-強度曲線（time-intensity curve，TIC）各參數(shù)的變化，目的是探究TIC曲線中各參數(shù)在評估藥物治療RIRI的臨床意義，以期為臨床治療RIRI提供一種有效的監(jiān)測方法。

1 材料與方法

1.1 動物分組健康雄性SD大鼠18只（體質(zhì)量200～250 g、由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），術(shù)前所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進食飲水，將所有大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、地塞米松藥物組（Dexa組）3組，每組各6只。Dexa組術(shù)前1 h給予地塞米松（4 mg/kg）腹腔注射給藥，Sham組與I/R組術(shù)前給予等量的0.9%的生理鹽水腹腔注射給藥。

1.2 動物模型的建立10%的水合氯醛腹腔注射麻醉（2 mL/kg，規(guī)格1 mL：100 mg），術(shù)前二維超聲定位雙側(cè)腎臟位置，雙腎區(qū)剃毛，碘伏消毒，大鼠俯臥位，行縱行切口，逐層分離，游離輸尿管，用2.0 mm的手術(shù)線結(jié)扎大鼠腎蒂后切除右側(cè)腎臟，左側(cè)腎蒂使用無損傷血管夾夾閉45 min，根據(jù)左腎顏色來判斷缺血情況，腎臟由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色，表明缺血成功，45 min后松開血管夾進行再灌注，待腎臟由暗紅色轉(zhuǎn)為鮮紅色，恢復(fù)血液供應(yīng)后再將其還納至腹腔并縫合切口，假手術(shù)組僅切除右腎并分離左側(cè)腎蒂，不進行鉗夾處理。術(shù)后自由進食飲水。

1.3 超聲造影檢查所有實驗大鼠術(shù)后24 h麻醉、固定。選取西門子ACUSON S3000超聲診斷儀9L4變頻線陣探頭，在普通二維超聲下觀察腎臟的大小及血流灌注，然后取大鼠左側(cè)腎臟最大冠狀切面，固定探頭，進入造影模式，設(shè)定相關(guān)超聲造影參數(shù)：頻率4.0 MHz、深度4 cm，機械指數(shù)MI0.1，Sonovue（上海博萊科信誼有限責任公司包裝，BRACC0 Imaging，B.V 公司生產(chǎn)），規(guī)格：59 mg六氟化硫，25 mg，按說明將凍干粉注入生理鹽水5 mL，配置成微泡懸液，按0.4 mL/kg的劑量，抽取震蕩混勻后的造影劑，經(jīng)大鼠尾靜脈快速注射，隨后注射0.2 mL的生理鹽水沖洗，啟動超聲儀內(nèi)置計時器，同步采集并保存動態(tài)影像3 min，運用西門子公司所提供的隨機攜帶的（Auto tracking contrast quantification，ACQ）定量分析軟件分析，將感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）面積0.05 mm2的圓形，放置于腎最大冠狀截面中央的外層皮質(zhì)，繪制TIC曲線，觀察和分析如下參數(shù)：達峰濃度（Peak），達峰時間（TP），曲線下面積（AUC），平均渡越時間（MTT）。所有參數(shù)測量3次取均值以減少誤差。

1.4 腎功能的檢測超聲造影結(jié)束后，取大鼠下腔靜脈血2.0 mL，室溫離心（3 000 r/min，10 min），取上清液，送西南醫(yī)科大學(xué)檢驗科，對血肌酐（Crea）及尿素（Urea）進行生化檢測。

1.5 腎臟病理檢測取血結(jié)束后，處死大鼠，快速摘取大鼠左側(cè)腎臟，切取1/2腎臟組織，用10%的中性甲醛固定，行石蠟包埋，取石蠟切片后行HE染色，送于西南醫(yī)科大學(xué)病理科進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計軟件SPSS20.0用于統(tǒng)計描述與推斷，定量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準為0.05，當P＜0.05，認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎皮質(zhì)超聲造影TIC曲線經(jīng)大鼠尾靜脈團注超聲造影劑后，可以觀察到正常大鼠的腎臟按腎動脈（腎動脈主干、段動脈、葉間動脈、弓形動脈）、腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)的順序依次明顯增強，呈“火球樣改變”，迅速達到峰值強度后按腎髓質(zhì)、腎皮質(zhì)、腎動脈的順序緩慢下降至基礎(chǔ)水平。分析感興趣區(qū)域，可見Sham組（圖1A）TIC曲線上升陡直，迅速達峰后，又快速下降，腎臟缺血再灌注損傷后，腎功能受損，腎臟血流動力學(xué)出現(xiàn)障礙，腎臟I/R組（圖1B）TIC曲線表現(xiàn)為上升和下降均減慢。較腎臟I/R組相比較，預(yù)先注射地塞米松后，Dexa組（圖1C）腎臟血流動力學(xué)障礙得到改善，TIC曲線上升和下降過程有所增快，但較Sham組相比較，仍較緩慢。

圖1 各組大鼠腎臟皮質(zhì)血流灌注TIC曲線Fig.1 The TIC curve of renal cortical perfusion in rats

2.2 腎皮質(zhì)TIC曲線各參數(shù)分析應(yīng)用單因素方差分析的方法比較各組之間Peak、TP、AUC、MTT值有無差異，分析結(jié)果顯示：I/R組、Dexa組相比較，Peak值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Sham、I/R、Dexa 3組TP、AUC、MTT值相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），分析結(jié)果顯示TIC曲線Peak值的變化不能完全反映腎皮質(zhì)血流灌注的變化情況，見表1。

表1 各組腎皮質(zhì)TIC曲線參數(shù)相比較Tab.1 Comparison of parameters of renal cortex TIC curve in each group x±s

2.3 地塞米松減輕缺血再灌注損傷腎臟的病理學(xué)改變?yōu)榱俗C實上述結(jié)果，觀察了腎臟組織切片病理改變。觀察發(fā)現(xiàn)，與Sham組（圖2A）相比，腎臟缺血再灌注損傷24 h后腎損傷明顯。腎臟I/R組表現(xiàn)為腎小管擴張，輪廓欠清，胞漿內(nèi)空泡形成，以氣球樣變性為主，腎小管上皮細胞刷狀緣脫落，腎間質(zhì)充血、水腫，炎癥細胞浸潤明顯（圖2B）。與之相反，觀察Dexa組腎組織病理切片發(fā)現(xiàn)腎小球輕度淤血，腎小管上皮細胞輕度腫脹，間質(zhì)輕度水腫（圖2C），說明地塞米松的處理可以減輕腎臟病理學(xué)損傷。

圖2 各組大鼠腎臟病理學(xué)形態(tài)（HE×200）Fig.2 Kidney pathological morphology of rats in different groups（HE × 200）

2.4 地塞米松減輕腎缺血再灌注損傷與Sham組相比，腎臟I/R組Crea水平（69.33±12.02）μmol/L約是Sham組水平的3倍，Urea水平（29.11±6.08）mmol/L約是Sham組水平的4倍，表明腎臟缺血再灌注損傷后，腎功能下降（P＜0.05）。與腎臟I/R組相比，Dexa組Crea（41.10± 7.83）μmol/L及Urea水平（14.18±1.28）mmol/L均低于腎臟I/R組，提示地塞米松的使用使腎功能有所好轉(zhuǎn)，見表2。

3 討論

本實驗用CEUS技術(shù)監(jiān)測地塞米松治療大鼠RIRI后的療效，進一步證明了地塞米松可以減輕大鼠RIRI。與腎臟I/R組相比，地塞米松的使用降低了血Crea、Urea的水平，減輕了腎臟組織病理損傷，超聲造影腎皮質(zhì)TIC曲線中TP、MTT、AUC值也表現(xiàn)出了與此一致的變化。

表2 各組生化指標的比較Tab.2 comparison of biochemical indexes in each group x±s

現(xiàn)在我國批準上市的超聲造影劑聲諾維（Son-oVue）的主要化學(xué)成分為脂質(zhì)鞘包裹的六氟化硫微泡，是一種理想的血流示蹤劑，能夠隨血液流動分布至全身，不會溢出至組織間隙或尿液內(nèi)，隨呼吸運動經(jīng)肺排出，不具有腎毒性，且不會影響被檢查系統(tǒng)［5-6］。通過分析計算感興趣區(qū)域（Region of interest，ROI）造影劑強度隨時間的變化情況，生成TIC曲線，同時分析軟件還可根據(jù)稀釋規(guī)律的GAMMA擬合曲線對TIC曲線進行回歸性分析，得到峰值強度（Peak）、達峰時間（TP）、平均渡越時間（MTT）、曲線下面積（AUC）等，以量化的方式反映了器官組織內(nèi)毛細血管的實時血流特點。因此超聲造影技術(shù)被廣泛的應(yīng)用臨床，包括對腎臟、肝臟、胰腺、脾臟、乳腺、甲狀腺及睪丸等疾病的診斷及療效評估中。研究表明，很多腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后都與血流灌注的改變相關(guān)，其中腎皮質(zhì)血流灌注約占整個腎臟的90%，因此選擇腎皮質(zhì)作為感興趣區(qū)域可以反映出整個血流腎臟的血流灌注情況。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腎皮質(zhì)TIC曲線中的定量參數(shù)所反映的腎臟血流灌注變化通常早于患者生化檢驗中的血肌酐和血尿素氮所反映的腎功能變化［7］。

地塞米松是一種常用的糖皮質(zhì)激素，研究證明其可以減輕許多器官的缺血再灌注損傷，如腦、心臟、腎臟，肺、腸道及止血帶引起小鼠后肢急性缺血再灌注損傷等［8］。其保護機制可能是由于以下原因：（1）糖皮質(zhì)激素的受體廣泛的分布于在肺、肝臟、腎臟及其他器官中，當皮質(zhì)激素與其受體結(jié)合后，復(fù)合物進入細胞核內(nèi)迅速找到DNA上特異的結(jié)合位點并與之結(jié)合從而啟動轉(zhuǎn)錄過程，誘導(dǎo)或阻止特異蛋白的合成發(fā)揮其藥理效應(yīng)；（2）其可以穩(wěn)定細胞膜，減少炎癥因子及介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，減輕局部炎癥反應(yīng)；（3）地塞米松還可以抑制中性粒細胞和內(nèi)皮細胞的黏附，防止微血栓阻塞毛細血管，改善微循環(huán)以解決再灌注時的無復(fù)流現(xiàn)象。

本實驗中缺血再灌注24 h后腎臟血流動力學(xué)出現(xiàn)明顯改變，本實驗中Peak值Dexa＞I/R＞sham組，其中I/Rvs.Dexa組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），這與羅志建等［9］所得出實驗結(jié)果一致，原因可能為Peak所表示感興趣區(qū)域中造影劑增強達到峰值時的信號強度，是瞬時的，累計效應(yīng)不明顯，因此Peak值不能完全作為反映腎皮質(zhì)血流灌注的定量指標。腎臟I/R 24 h后，TP、MMT延長，AUC增加，其中TP是指超聲造影劑開始進入腎皮質(zhì)至達到最大強度的時間，MTT表示造影劑開始增強時間至峰值濃度下降一半的時間，反映了造影劑的灌注速度和廓清速度。RIRI發(fā)病機制復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)是被廣泛認可的一種機制［10］，缺血缺氧導(dǎo)致血管反應(yīng)性的收縮、內(nèi)皮細胞及各種炎癥因子的浸潤、瘀滯，微循環(huán)血栓的形成，導(dǎo)致腎皮質(zhì)血流速度的減低，表現(xiàn)為造影劑灌注速度與廓清速度的減低，在TIC曲線中表現(xiàn)為MTT、TP的延長。AUC反映的是在一定時間內(nèi)所選取ROI的累積效應(yīng)，RIRI血管內(nèi)皮細胞通透性增加，大量炎性細胞瘀滯于微血管和間質(zhì)中，炎性細胞對造影劑有一定的吞噬作用，使被吞噬的微泡繼續(xù)保留聲學(xué)活性，最終形成造影增強的累積效應(yīng)，使AUC增加。外源性給予地塞米松后，MMT、TP時間縮短，AUC減低，分析原因可能是地塞米松減緩了炎癥介質(zhì)的釋放及炎癥細胞的浸潤，降低微循環(huán)阻力，改善腎皮質(zhì)血流灌注速度，表現(xiàn)為造影劑的灌注和廓清速度加快，因此在TIC曲線中表現(xiàn)為TP、MMT的縮短。炎癥的抑制使炎癥細胞對微泡的吞噬量減少，一定時間內(nèi)造影微泡累積量減少，在TIC曲線上表現(xiàn)為AUC的減少。

既往研究證明CEUS技術(shù)在評價移植腎術(shù)后血管并發(fā)癥、腎實質(zhì)占位的鑒別、腎腫瘤的治療及術(shù)后隨訪、慢性腎病、梗阻性腎病中都有一定的價值和較高的敏感性［11-12］。圍手術(shù)期由缺血再灌注損傷的引起的AKI是一種常見且具有破壞性的并發(fā)癥，并常常并發(fā)呼吸衰竭、敗血癥和多器官功能障礙綜合征，目前并沒有一種有效的特定的治療方法［13］。因此目前CEUS技術(shù)在臨床評價藥物治療RIRI研究相對較少，且超聲造影TIC曲線中各參數(shù)在評價藥物改善腎實質(zhì)血流灌注中尚無統(tǒng)一的標準，仍需要進一步的研究。因此本實驗用CEUS技術(shù)評價地塞米松治療大鼠RIRI后微循環(huán)的變化，并初步探討了TIC曲線中各參數(shù)的參考價值，具有一定的創(chuàng)新性。但實驗仍存在以下不足：（1）樣本量相對較少；（2）研究范圍較為局限，只選取了24 h一個時間點作為研究；（3）超聲造影觀察和分析的是一個二維切面，并不能完全代表腎臟的整體情況，有待向三維立體超聲造影方向發(fā)展。下一步研究將擴大研究樣本量及研究范圍，進一步探討TIC曲線中各參數(shù)的參考價值，以期為臨床上藥物治療RIRI的療效監(jiān)測提供理論依據(jù)。

綜上所述，超聲造影技術(shù)TIC曲線中TP、MMT、AUC等指標在監(jiān)測和評估藥物改善大鼠腎缺血再灌注損傷中的具有較大的參考價值。腎缺血再灌注損傷發(fā)病機制復(fù)雜，若想進一步為臨床治療提供一個有效的診斷信息，則還需要大量實驗研究，因此超聲造影技術(shù)有著巨大的研究前景，有待進一步的研究。