煙草赤星病菌拮抗菌的篩選鑒定及發(fā)酵液穩(wěn)定性分析*

張艷軍， 郭 榮

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

煙草赤星病是在煙草成熟期發(fā)生的一種真菌性葉斑類病害[1]，不但會(huì)影響烤煙產(chǎn)量、產(chǎn)值，還會(huì)影響煙葉的評(píng)吸質(zhì)量[2].在我國(guó)，煙草赤星病在煙草產(chǎn)區(qū)發(fā)生較普遍，一般煙田發(fā)病率為5%～10%，重病田達(dá)10%～20%，嚴(yán)重發(fā)病田甚至可達(dá)50%以上，是煙草生產(chǎn)上威脅最大的病害之一[3].目前煙草生產(chǎn)中化學(xué)防治是防治煙草赤星病的重要措施，缺點(diǎn)是容易引起病原菌產(chǎn)生耐藥性、造成農(nóng)藥殘留和污染環(huán)境[4].隨著對(duì)煙草及煙草制品安全性要求的提高，減少化學(xué)農(nóng)藥使用、生產(chǎn)綠色產(chǎn)品已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中新的發(fā)展方向.因此,生物防治越來(lái)越引起煙草界的關(guān)注.

篩選煙草赤星病菌拮抗菌是實(shí)施生物防治的一項(xiàng)重要工作，也是國(guó)內(nèi)外科研工作者研究的熱點(diǎn)，對(duì)于解決煙草生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留及環(huán)境保護(hù)方面都具有重要意義.研究以煙草赤星病菌為指示菌，通過(guò)瓊脂塊法和管碟法從土壤中篩選對(duì)煙草赤星病菌抑菌效果明顯的拮抗菌株，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行分類鑒定和抗菌譜測(cè)定，同時(shí)對(duì)拮抗菌發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性進(jìn)行研究，期望為后續(xù)分離純化實(shí)驗(yàn)提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來(lái)源

煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、楊樹(shù)潰瘍病菌(Dothiorelagregaria)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、小麥赤霉病菌(Gibberellazeae)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporium)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張應(yīng)烙老師惠贈(zèng).

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)和PD液體培養(yǎng)基組成見(jiàn)文獻(xiàn)[5].鑒定培養(yǎng)基為固體淀粉培養(yǎng)基、糖發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、Simons氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基等[6].

1.2 方 法

1.2.1 煙草赤星病菌拮抗菌株的篩選

首先采用稀釋涂布平板法[6]對(duì)采集土樣中放線菌株進(jìn)行分離純化，將獲得的菌株接種至試管斜面，并在4 ℃條件下保藏.采用瓊脂塊法[7]對(duì)分離得到的放線菌進(jìn)行初篩，獲得對(duì)煙草赤星病菌具有抑菌活性的拮抗菌株.最后采用管碟法[8]對(duì)初篩獲得的拮抗菌株進(jìn)行復(fù)篩，獲得對(duì)煙草赤星病菌拮抗能力最強(qiáng)的放線菌菌株ZJNU968，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.2 煙草赤星病菌拮抗菌株的分類鑒定

菌株形態(tài)觀察和生理生化測(cè)定參照文獻(xiàn)[6]，同時(shí)對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行測(cè)定，并運(yùn)用軟件MEGA 5.05按照Neighbour-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定未知菌種的分類地位.

1.2.3 煙草赤星病菌拮抗菌株抗菌譜測(cè)定

煙草赤星病菌為真菌性植物病原菌，因此，利用管碟法考察了拮抗菌發(fā)酵液對(duì)其他真菌性病原菌，如楊樹(shù)潰瘍病菌、番茄早疫病菌、小麥赤霉病菌和黃瓜枯萎病菌的抑菌效果.為了考察拮抗菌是否能拮抗非真菌性植物病原菌，利用管碟法考察了拮抗菌發(fā)酵液對(duì)細(xì)菌性病原菌水稻白葉枯病菌的抑菌效果.

1.2.4 拮抗菌株發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性測(cè)定

將斜面保藏的拮抗菌株接種至PDA平板，并置于28 ℃培養(yǎng)箱.5 d后用打孔器取直徑6 mm的菌塊至1.5 mL離心管，加入1 mL無(wú)菌水，洗下菌體和孢子，一并接入到250 mL搖瓶(含有30 mL PD液體培養(yǎng)基).將該搖瓶置于180 r/min,28 ℃的搖床中培養(yǎng)5 d，然后將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至80 mL離心管中，并在10 000 r/min條件下離心15 min.所得上清液用于發(fā)酵液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，其處理方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[5]，并采用管碟法檢測(cè)抗菌活性，同時(shí)以原始無(wú)菌發(fā)酵濾液作為對(duì)照.

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草赤星病菌拮抗菌株的篩選

從浙江省金華市婺城區(qū)采集的16份土樣中篩選得到224株放線菌，以煙草赤星病菌為指示菌，采用瓊脂塊法篩選出6株具有拮抗作用的放線菌，其抑菌圈直徑為1.20～2.90 cm.在此基礎(chǔ)上，采用管碟法對(duì)初篩得到的6株拮抗菌株進(jìn)行復(fù)篩，其中以菌株ZJNU968的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到3.60 cm.因此，將該菌株用于后續(xù)試驗(yàn).

2.2 拮抗菌ZJNU968分類鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)特征

菌株ZJNU968在PDA培養(yǎng)基上菌落較小、圓形、微隆起、干燥、邊緣整齊且不透明.菌落正面初期為白色，5 d后呈現(xiàn)灰色，菌落背面呈微黃色.該菌株氣生菌絲和基內(nèi)菌絲均很豐富，且有大量分枝，孢子絲呈螺旋狀，孢子呈短圓柱形.

2.2.2 菌株生理生化特性

菌株ZJNU968淀粉水解現(xiàn)象明顯，可以使明膠液化，能利用葡萄糖、乳糖生長(zhǎng).該菌株糖發(fā)酵試驗(yàn)(葡萄糖和乳糖)、甲基紅試驗(yàn)、伏普試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)均為陰性，檸檬酸鹽試驗(yàn)為陽(yáng)性.

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

菌株ZJNU968的16S rDNA基因序列(1 443 bp)己提交至GenBank網(wǎng)站(基因庫(kù)登錄號(hào)為JX235956).從GenBank,EzTaxon等數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)集鏈霉菌屬相關(guān)菌株16S rDNA序列，并以青孢鏈霉菌(Streptomycesglaucosporus)為外群,按照N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖1所示.菌株ZJNU968與StreptomyceslunalinharesiiRCQ1071[9]處于同一進(jìn)化分支，二者序列相似性達(dá)98%，而且二者形態(tài)特征和生理生化特征基本一致.因此,確定菌株ZJNU968為Streptomyceslunalinharesii.

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀關(guān)系圖

2.3 拮抗菌ZJNU968抗菌譜測(cè)定

抗菌譜測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1.結(jié)果表明：StreptomyceslunalinharesiiZJNU968菌株發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病菌和水稻白葉枯病菌抑菌圈直徑分別為2.95 cm和3.41 cm，同時(shí)對(duì)其他3種供試病原菌也有較強(qiáng)的抑制性.因此,ZJNU968菌株發(fā)酵液中含有的抗菌活性物質(zhì)具有較為廣譜的抗菌活性.

表1 ZJNU968菌株發(fā)酵液抗菌譜測(cè)定

2.4 拮抗菌株ZJNU968發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性測(cè)定

2.4.1 熱穩(wěn)定性

由圖2可知，拮抗菌發(fā)酵液中生物活性物質(zhì)隨溫度升高而抑菌活性逐步下降.在30 ℃時(shí)，拮抗菌株ZJNU968發(fā)酵液對(duì)煙草赤星病菌的抑菌圈直徑達(dá)3.80 cm，與對(duì)照相當(dāng)；在50 ℃時(shí)，該菌株發(fā)酵液保持良好的抑菌效果，抑菌圈直徑為3.10 cm；在90 ℃時(shí)，菌株ZJNU968發(fā)酵液抑菌活性顯著下降，抑菌圈直徑減至2.35 cm；在121 ℃時(shí)，發(fā)酵液抑菌活性全部喪失.因此,拮抗菌ZJNU968發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，但高溫會(huì)破壞其結(jié)構(gòu).

2.4.2 酸堿穩(wěn)定性

拮抗菌株ZJNU968發(fā)酵液pH被分別調(diào)至2.77,3.48,4.34,5.26,6.12,7.16,8.28,9.22,10.30，其中5.26為原始發(fā)酵液的pH值.由圖3可知：在pH 2.77～4.34時(shí)，抑菌圈直徑略低于對(duì)照pH 5.26；在pH 5.26～7.16時(shí)，發(fā)酵液抑菌活性與原始發(fā)酵液相近；在pH 8.28下發(fā)酵液抑菌活性最強(qiáng)，隨著pH進(jìn)一步增加，發(fā)酵液抑菌活性均呈逐步下降趨勢(shì).因此,拮抗菌ZJNU968發(fā)酵液在pH 2.77～10.30時(shí)具有良好的穩(wěn)定性.

*表示P< 0.05;**表示P<0.01

圖3 pH對(duì)ZJNU968菌株發(fā)酵液抑菌活性影響

2.4.3 光照穩(wěn)定性

由圖4可知，在紫外光下照射1,2,4 h的ZJNU968菌株發(fā)酵液抑菌圈直徑與對(duì)照相當(dāng).因此,紫外光照射對(duì)發(fā)酵液抑菌活性無(wú)影響.由圖5可知，在自然光下照射3,6 h后的ZJNU968發(fā)酵液抑菌圈直徑與對(duì)照接近，自然光照射9 h的發(fā)酵液抑菌圈直徑略有下降，但仍有3.07 cm.因此,拮抗菌ZJNU968發(fā)酵液具有良好的光照穩(wěn)定性.

3 討 論

煙草赤星病于1892 年首先在美國(guó)發(fā)現(xiàn),多次給世界煙葉生產(chǎn)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失[10].在1916年，人們首次在北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)了煙草赤星病，隨后該病害在全國(guó)各地慢慢被報(bào)道.目前各地主要采用抗病育種、化學(xué)防治、生物防治、農(nóng)業(yè)防治等方法防治煙草赤星病[11].目前,生物防治煙草赤星病是一種比較有效和發(fā)展?jié)摿^大的防治方法，認(rèn)為是目前最安全的防治措施，符合環(huán)境保護(hù)和有機(jī)食品發(fā)展要求[12].當(dāng)前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)煙草赤星病菌拮抗菌的研究已經(jīng)取得了一些成果.廉立慧等[13]采用對(duì)峙平板法從茄子根圍土壤中篩選得到一株對(duì)煙草赤星病菌有明顯拮抗作用的多產(chǎn)色鏈霉Q14，其抑菌帶寬為1.45 cm，并且該菌株對(duì)黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌也有較強(qiáng)的拮抗作用.馬志遠(yuǎn)等[14]從煙草表面及根際土壤中分離得到1株對(duì)煙草赤星病有拮抗效果的解淀粉芽孢桿菌M-07C2F，其抑菌條帶寬度達(dá)1.42 cm.筆者利用瓊脂塊法和管碟法從土壤中篩選得到一株對(duì)煙草赤星病菌具有良好抑菌活性的菌株ZJNU968，同時(shí)該菌株具有較為廣譜的抗菌活性，對(duì)其他5種供試病原菌皆具有較強(qiáng)的抑制活性.根據(jù)該菌株的形態(tài)特征、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果，確定該菌株為Streptomyceslunalinharesii.目前研究表明，Streptomyceslunalinharesii對(duì)香蕉枯萎病[15]、短小芽孢桿菌LF-4[16]具有一定的抑制作用，但本研究所發(fā)現(xiàn)的Streptomyceslunalinharesii對(duì)煙草赤星病菌的抑菌活性尚屬首次報(bào)道.

圖4 紫外光對(duì)ZJNU968菌株發(fā)酵液抑菌活性影響

*表示P< 0.05

近年來(lái)發(fā)展形成的生物與化學(xué)協(xié)同控制植物病害策略，既能有效地控制病害的發(fā)生，又能降低化學(xué)藥劑在農(nóng)副產(chǎn)品中的殘留，這就要求所用的抗菌活性物質(zhì)要具有良好的穩(wěn)定性，才能在與化學(xué)藥劑混合使用中保持較高活性.本研究對(duì)ZJNU968菌株發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性研究結(jié)果表明：拮抗菌ZJNU968發(fā)酵液具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，但90 ℃以上的高溫會(huì)對(duì)其活性造成嚴(yán)重影響；該拮抗菌發(fā)酵濾液在pH 2.77～10.30內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，同時(shí)也具有良好的光照穩(wěn)定性.此外，拮抗菌ZJNU968所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)對(duì)煙草赤星病菌的抑菌圈直徑達(dá)到了3.60 cm，優(yōu)于多產(chǎn)色鏈霉菌Q14(1.45 cm)、芽孢桿菌M-07C2F(1.42 cm)和枯草芽孢桿菌L3(1.70 cm)[17]，有望將其開(kāi)發(fā)成一種新型生物農(nóng)藥，用于煙草赤星病的防治.目前本實(shí)驗(yàn)室正在對(duì)菌株ZJNU968發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)解析，后續(xù)還將進(jìn)一步研究活性物質(zhì)的抑菌機(jī)理和田間防治效果.