酶解法制備薏米汁的工藝優(yōu)化

馬 丹，楊源源，張煥琴，李秀芳，李豐岳，孫 強(qiáng)

（荊楚理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，湖北 荊門 448000）

薏米又名薏苡仁、苡仁、米仁、川谷，既是一種中藥，又是一種天然美容食品?！吨袊朝煷蟮洹酚涊d：薏米含蛋白質(zhì)14%，脂肪5%，碳水化合物65%，鈣0.7%，磷0.242%，人體必需的8種氨基酸齊全且比例接近人體需要[1-3]。薏米有健脾補(bǔ)胃，清熱祛濕，降血脂，抗氧化、抗病毒、抗細(xì)菌感染，減輕炎癥活性的功效[4]。

近年來，隨著人們保健意識的增強(qiáng)，再加上薏米的藥食同源特性，相關(guān)產(chǎn)品的研究與開發(fā)也逐漸深入和廣泛。在國外，特別是日本開發(fā)出新型薏米食品，其中80%是發(fā)酵飲料。我國目前以薏米為原料的加工產(chǎn)品主要有飲料和發(fā)酵制品，如薏米酒、薏米乳酸飲料、薏米發(fā)酵飲料和薏米醋等[5-6]。國內(nèi)對薏米中的淀粉大多是采用淀粉酶進(jìn)行水解得到酶解液，制備薏米飲料。曠慧等[7]以薏米的焙烤溫度、焙烤時(shí)間、淀粉酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH為實(shí)驗(yàn)因素建立了制備薏米汁的工藝，在此條件下得到的薏米汁中還原糖含量達(dá)到1.4818 g/100 g，呈乳白色，香味濃郁、味道純正。周輝[8]研究表明，薏米淀粉糖化的最佳酶解工藝條件為溫度55℃，pH值為6.6，酶添加量300 U/g，在此條件下可生產(chǎn)出品質(zhì)優(yōu)良、穩(wěn)定性好的澄清型薏米汁。薏米中的蛋白質(zhì)是優(yōu)質(zhì)蛋白[9]，韓麗麗[10]對薏米蛋白進(jìn)行超聲提取，通過中性蛋白酶和堿性蛋白酶聯(lián)合酶解薏米得到薏米抗氧化肽，DPPH自由基清除率達(dá)到93.21%，證明薏米蛋白酶解后抗氧化活性更強(qiáng)，因而對薏米蛋白進(jìn)行酶解具有重要的意義。木瓜蛋白酶對許多蛋白質(zhì)都有水解作用，具備酶活性高、熱穩(wěn)定性好、無毒副作用、天然衛(wèi)生安全等特點(diǎn)，并且資源豐富，取材簡便[11-13]，因此，可利用木瓜蛋白酶對薏米蛋白進(jìn)行水解。

本項(xiàng)目通過采用α-淀粉酶和木瓜蛋白酶先后對薏米中富含的淀粉及蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，以還原糖含量和氮溶解指數(shù)（nitrogen solubility index，NSI）為檢測指標(biāo)，采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化淀粉酶及蛋白酶酶解工藝條件，獲得富含還原糖和可溶性氮的薏米汁。初步探討兩種酶的聯(lián)合應(yīng)用，為薏米飲品深加工技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米（荊門市東寶區(qū)種植）：市售；α-淀粉酶（1000U/g）：北京索萊寶科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活10 000 U/g）：鄭州升達(dá)食品添加劑有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；JY1002電子天平：上海上天精密有限公司；KDN-103F凱氏定氮儀：上海纖檢儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 薏米汁加工工藝流程及操作要點(diǎn)

薏米→篩選→清洗→烘干→粉碎→調(diào)漿→淀粉酶酶解→滅酶→木瓜蛋白酶酶解→滅酶→離心→成品

新鮮薏米，將其洗凈后進(jìn)行烘干，將薏米顆粒粉碎至80目，用純水將薏米粉調(diào)成漿，分別用α-淀粉酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行兩步酶解，滅酶后離心，過濾，所得濾液即薏米汁終產(chǎn)品。

操作要點(diǎn)[14-16]：

篩選：要求薏米仁粒飽滿，色白，無蟲蛀，無霉斑，脫殼完全，除去殘留殼和砂礫等雜質(zhì)。

清洗：將篩選過的薏米用清水洗凈，進(jìn)一步除去細(xì)小雜質(zhì)，將水瀝干。

烘干：將薏米在烘盤上攤薄，放入烘箱，在60℃條件下干燥備用。

粉碎：將薏米用粉碎機(jī)粉碎，再過80目篩，過篩后的薏米粉置于干燥的容器中，低溫避光保藏。

調(diào)漿：將薏米粉按料水比為1∶10（g∶mL）調(diào)成漿，于90℃水浴加熱至完全糊化，冷卻得到薏米漿。

淀粉酶酶解：向冷卻至室溫的薏米漿中加入300 U/g的α-淀粉酶，在65℃條件下酶解3 h。

滅酶：將淀粉酶酶解薏米漿置于100℃水浴中，將淀粉酶滅活。

木瓜蛋白酶酶解：將前述得到的淀粉酶酶解薏米漿中加入100 U/g的木瓜蛋白酶，在50℃條件下酶解6 h。

滅酶：將木瓜蛋白酶酶解薏米漿置于100℃水浴中，將木瓜蛋白酶滅活。

離心：木瓜蛋白酶酶解后，4 000 r/min離心10 min，取上清液，得到薏米汁。

1.3.2 分析檢測

還原糖含量的測定采用堿性銅鹽法中的直接滴定法[17]；氮溶解指數(shù)（NSI）的測定[18-20]：取10 mL薏米汁，采用凱氏定氮法測定薏米汁中總氮含量，氮溶指數(shù)計(jì)算公式如下：

1.3.3 淀粉酶酶解工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以薏米汁中還原糖含量為評價(jià)指標(biāo)，分別考察酶解溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），酶解時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）及酶添加量（100 U/g、200 U/g、300 U/g、400 U/g、500 U/g），通過單因素試驗(yàn)來確定α-淀粉酶酶解薏米的最適酶解溫度、酶解時(shí)間和酶添加量。

1.3.4 淀粉酶酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用酶解時(shí)間（A），酶解溫度（B），酶添加量（C）這3個因素，以酶解后薏米汁中還原糖含量為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化酶解工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平表見1。

表1 淀粉酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzymatic hydrolysis conditions optimization by α-amylase

1.3.5 蛋白酶酶解工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

向經(jīng)過α-淀粉酶最佳條件酶解得到的薏米汁中加入木瓜蛋白酶，以氮溶解指數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)分別考察木瓜蛋白酶的酶解溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃），酶解時(shí)間（2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）及酶添加量（40 U/g、80 U/g、120 U/g、160 U/g、200 U/g），進(jìn)一步確認(rèn)木瓜蛋白酶酶解薏米的最適酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量。

1.3.6 蛋白酶酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酶解時(shí)間（A），酶解溫度（B），酶添加量（C）為評價(jià)因素，以酶解后薏米汁中氮溶解指數(shù)為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化蛋白酶酶解工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平表見2。

表2 蛋白酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for enzymatic hydrolysis conditions optimization by protease

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶酶解工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解溫度對薏米汁中還原糖含量的影響

α-淀粉酶添加量為250 U/g，酶解時(shí)間為2 h的條件下，設(shè)置酶解溫度依次為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，考察酶解溫度對薏米汁中還原糖含量的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在α-淀粉酶添加量為250 U/g，酶解時(shí)間為2 h的條件下，酶解溫度在40～80℃時(shí)，隨著溫度的不斷升高，薏米汁中還原糖的含量也在慢慢升高，并在60℃時(shí)達(dá)到頂峰。隨后，隨著溫度的升高，薏米汁中還原糖含量逐漸降低，這可能是當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，α-淀粉酶部分失活。因此制備薏米汁的最佳淀粉酶酶解溫度為60℃。

圖1 不同酶解溫度對α-淀粉酶酶解薏米汁中還原糖含量的影響Fig.1 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on reducing sugar contents in coix seed juice hydrolyzed by α-amylase

2.1.2 酶解時(shí)間對薏米汁中還原糖含量的影響

在α-淀粉酶添加量為250 U/g，酶解溫度為70℃的條件下，設(shè)置酶解時(shí)間依次為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，考察酶解時(shí)間對薏米汁中還原糖含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同酶解時(shí)間對α-淀粉酶酶解薏米汁中還原糖含量的影響Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis time on reducing sugar contents in coix seed juice hydrolyzed by α-amylase

由圖2可知，在α-淀粉酶添加量為250 U/g，酶解溫度為70℃的條件下，酶解時(shí)間為1～3 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長，還原糖含量呈上升趨勢，并在3 h時(shí)達(dá)到頂峰，酶解時(shí)間3～5 h時(shí)，還原糖含量呈下降趨勢。因此，可以得知制備薏米汁的最佳酶解時(shí)間為3 h。

2.1.3 α-淀粉酶添加量對薏米汁中還原糖含量的影響

在溫度70℃，酶解3 h的條件下，設(shè)置α-淀粉酶添加量依次為100 U/g 、200 U/g、300 U/g、400 U/g、500 U/g，考察酶添加量對薏米汁中還原糖含量的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在酶解溫度70℃，酶解時(shí)間3 h的條件下，當(dāng)α-淀粉酶添加量為100～500 U/g時(shí)，隨著α-淀粉酶添加量的增多，薏米汁的還原糖含量也在慢慢增多，并在α-淀粉酶添加量為300 U/g時(shí)達(dá)到頂峰，此時(shí)薏米汁中還原糖含量為18.9 mg/mL。隨后，當(dāng)α-淀粉酶添加量繼續(xù)增大，薏米汁中還原糖含量并不增加。因此，可以得知制備薏米汁的最佳α-淀粉酶添加量為300 U/g。

圖3 不同α-淀粉酶添加量對酶解薏米汁中還原糖含量的影響Fig.3 Effect of different α-amylase addition on reducing sugar contents in coix seed juice

2.2 淀粉酶酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶解時(shí)間，酶解溫度，酶添加量為試驗(yàn)因素，還原糖的含量為評價(jià)指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化用淀粉酶酶解制備薏米汁的最佳酶解條件，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 α-淀粉酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for enzymatic hydrolysis process optimization by α-amylase

由表3可知，3個因素對酶解的效果影響順序是A＞B＞C，其中酶解溫度（A）對試驗(yàn)效果影響最大，酶解時(shí)間（B）其次，酶添加量（C）對酶解的效果影響最小。綜合考慮各因素k值和R值比較，得到最佳因素水平為A2B3C3，即酶解溫度65℃，酶解時(shí)間3.5 h，淀粉酶添加量300 U/g。在此最佳條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果薏米汁中還原糖含量平均值為23.26 mg/mL。由表4可知，酶解溫度和酶解時(shí)間對結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），而酶添加量對結(jié)果沒有顯著影響（P＞0.05）。

表4 α-淀粉酶酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results of enzymatic hydrolysis process optimization by α-amylase

2.3 木瓜蛋白酶酶解工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 酶解溫度對薏米汁中氮溶解指數(shù)的影響

將經(jīng)過淀粉酶最佳酶解條件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶添加量為120 U/g，酶解時(shí)間為3 h條件下，設(shè)置酶解溫度依次為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，以酶解后薏米汁中氮溶解指數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見圖4。

圖4 不同酶解溫度對木瓜蛋白酶酶解薏米汁氮溶解指數(shù)的影響Fig.4 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on nitrogen solubility index of coix seed juice hydrolyzed by papain

由圖4可知，經(jīng)過淀粉酶最佳酶解條件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶添加量為120 U/g，酶解時(shí)間為3 h的條件下，隨著溫度的不斷升高，薏米汁中氮的含量也在慢慢升高，并在50℃時(shí)達(dá)到頂峰。隨后，隨著溫度的升高，薏米汁中氮溶解指數(shù)逐漸降低。因此，制備薏米汁的最佳酶解溫度為50℃。

2.3.2 酶解時(shí)間對薏米汁中氮溶解指數(shù)的影響

將經(jīng)過淀粉酶最佳酶解條件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶添加量為120 U/g，酶解溫度為50℃的條件下，設(shè)置酶解時(shí)間依次為2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，以酶解后薏米汁中總氮溶解指數(shù)為指標(biāo)，結(jié)果見圖5。

圖5 不同酶解時(shí)間對木瓜蛋白酶酶解薏米汁氮溶解指數(shù)的影響Fig.5 Effect of different enzymatic hydrolysis time on nitrogen solubility index of coix seed juice hydrolyzed by papain

由圖5可知，將經(jīng)過淀粉酶最佳酶解條件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶添加量為120 U/g，酶解溫度為50℃條件下，隨著時(shí)間的提高，氮溶解指數(shù)呈上升趨勢，并在5 h時(shí)達(dá)到平衡，之后一直處于平衡狀態(tài)，氮溶解指數(shù)不變。因此，可以得知木瓜蛋白酶最佳酶解時(shí)間為5 h。

2.3.3 酶添加量對薏米汁中氮溶解指數(shù)的影響

經(jīng)過淀粉酶最佳酶解條件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為50℃條件下，設(shè)置木瓜蛋白酶添加量依次為40 U/g、80 U/g、120 U/g、160 U/g、200 U/g，以酶解后薏米汁中氮溶解指數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見圖6。

圖6 不同木瓜蛋白酶添加量對酶解薏米汁氮溶解指數(shù)的影響Fig.6 Effect of different papain addition on nitrogen solubility index of coix seed juice

由圖6可知，經(jīng)過淀粉酶最佳條件酶解所得的薏米汁在木瓜蛋白酶酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為50℃的條件下，隨著木瓜蛋白酶添加量的增多，薏米汁的氮溶解指數(shù)也在增大，并在酶添加量為80 U/g時(shí)達(dá)到頂峰，此時(shí)薏米汁中氮溶解指數(shù)為82%。隨后，當(dāng)?shù)鞍酌傅奶砑恿坷^續(xù)增大，薏米汁中氮溶解指數(shù)并不增加，因此，可以得知制備薏米汁的最佳木瓜蛋白酶添加量為80 U/g。

2.4 木瓜蛋白酶酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，再以酶解時(shí)間，酶解溫度，酶添加量為試驗(yàn)因素，以氮溶解指數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化用木瓜蛋白酶酶解制備薏米汁的最佳酶解條件，所得的正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表5 木瓜蛋白酶酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for enzymatic hydrolysis process optimization by papain

表6 木瓜蛋白酶酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiments results for enzymatic hydrolysis process optimization by papain

由表5可知，3個因素對酶解的效果影響順序?yàn)锽＞A＞C，即酶解時(shí)間＞酶解溫度＞酶添加量。綜合考慮各因素k值和R值比較，得到最佳酶解工藝組合為A2B3C3，即酶解溫度50℃，酶解時(shí)間6 h，蛋白酶添加量100 U/g。在此最佳條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果薏米汁中氮溶解指數(shù)平均值為79.58%。由表6可知，3個因素均對結(jié)果有顯著影響（P＜0.05）。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，采用淀粉酶和木瓜蛋白酶結(jié)合的兩步酶解法制備薏米汁的最佳工藝條件為：α-淀粉酶酶解時(shí)間3.5 h，酶解溫度65℃，α-淀粉酶添加量300 U/g；木瓜蛋白酶酶解時(shí)間為6 h，酶解溫度為50℃，木瓜蛋白酶添加量為100 U/g。在此最佳酶解工藝條件下，薏米汁中還原糖含量達(dá)23.26 mg/mL，氮溶解指數(shù)達(dá)到79.58%。