超聲-乙醇法提取鐵皮石斛花總黃酮及其體外抗氧化性的研究

繆園欣，廖明星，孫愛紅，丁文文*

（1.荊楚理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，湖北 荊門 448000；2.湖北省荊門市畜牧獸醫(yī)局，湖北 荊門 448000；3.荊楚理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 荊門 448000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）具有“益胃生津、厚腸胃”的功效，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被譽(yù)為“滋陰圣品”[1]。對(duì)鐵皮石斛化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)其含有多糖[2]、氨基酸[3]、芪類[4-5]、生物堿[6]、黃酮[7]等成分。對(duì)鐵皮石斛藥理活性研究，發(fā)現(xiàn)其具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗輻射、調(diào)節(jié)免疫等功效[8-10]。鐵皮石斛主要以莖作為藥用部位，而其他部位未被藥用，造成了極大的浪費(fèi)[1]。對(duì)鐵皮石斛花的成分和功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其具有和莖相似的成分和功效[11-12]。黃酮類物質(zhì)廣泛存在于植物中[13]，對(duì)高血脂、高膽固醇等慢性疾病具有治療和預(yù)防作用，此外還具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎等活性[14-15]。目前，對(duì)鐵皮石斛黃酮的研究主要集中在莖和葉中的黃酮，而對(duì)石斛花中黃酮報(bào)道較少[16-17]。

植物黃酮提取方法有加熱提取法、有機(jī)溶劑提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取[18]等。其中超聲提取法具有溶劑用量少、提取速度快、提取效率高等特點(diǎn)[19-20]。因此本實(shí)驗(yàn)采用超聲-乙醇法對(duì)鐵皮石斛花總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)鐵皮石斛花總黃酮的體外抗氧化性進(jìn)行研究，為開發(fā)利用鐵皮石斛花提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛花：湖北洲和生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：南京杜萊生物科技有限公司；水楊酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；亞硝酸鈉、硫酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；無水乙醇（分析純）：武漢中南化工試劑有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）（分析純）：Sigma公司；試驗(yàn)用水為離子交換水。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF真空干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；TY-1901型分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；YJ1002型電子天平：上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；TG16-WS型低速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-100KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

取鐵皮石斛花于60℃烘箱中烘干，然后用萬能粉碎機(jī)粉碎，經(jīng)40目篩子得石斛花粉末備用。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取20 mg于105℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，加60%乙醇完全溶解定容，得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1.5 mL、3.0 mL、4.5 mL、6.0 mL、7.5 mL、9.0 mL、10.5 mL于25 mL容量瓶中，加入5%Na2NO21 mL，搖勻，靜置7 min。加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻靜置7 min。加入1 mol/L NaOH溶液10 mL，搖勻靜置12 min后用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇定容至刻度，靜置10 min，于波長510 nm處測(cè)吸光度值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 鐵皮石斛花總黃酮的測(cè)定

精密稱取鐵皮石斛花粉1 g，按不同的料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇，在100 W超聲功率下超聲輔助提取一定時(shí)間。提取完成后濃縮至20 mL，再用60%乙醇定容至50 mL得總黃酮提取液，按1.3.2的方法操作測(cè)得總黃酮濃度，并依據(jù)下列公式計(jì)算得出總黃酮提取率：

式中：C為石斛花樣品中總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣品溶液稀釋液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 鐵皮石斛花總黃酮提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)

（1）料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品，分別按1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g∶mL）的料液比加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，室溫浸泡18 h，于40℃條件下100 W超聲處理40 min。提取結(jié)束后濃縮、定容，測(cè)定吸光度值，并計(jì)算石斛花總黃酮得率。

（2）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品，按1∶35（g∶mL）的料液比分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，室溫浸泡18 h，于40℃條件下100 W超聲處理40 min。提取結(jié)束后濃縮、定容，測(cè)定吸光度值，并計(jì)算石斛花總黃酮得率。

（3）超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000g樣品，按1∶35（g∶mL）的料液比加入80%的乙醇，室溫浸泡18h，于40℃條件下100W超聲處理10min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min。提取結(jié)束后濃縮、定容，測(cè)定吸光度值，并計(jì)算石斛花總黃酮得率。

（4）超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品，按1∶35（g∶mL）的料液比加入80%的乙醇，室溫浸泡18 h，分別在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃條件下100W超聲處理40min。提取結(jié)束后濃縮、定容，測(cè)定吸光度值，并計(jì)算石斛花總黃酮得率。

1.3.5 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了確定最佳提取條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以石斛花總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)料水比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度4個(gè)因素在3個(gè)不同水平上進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 總黃酮提取工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for total flavonoids extraction conditions optimization

1.3.6 鐵皮石斛花黃酮體外抗氧化活性測(cè)定

（1）DPPH自由基清除能力測(cè)定

取0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、6.0 mg/mL、8.0 mg/mL、10.0 mg/mL的鐵皮石斛花總黃酮溶液各3 mL于試管中，分別加入1.0 mL 0.1 mmol DPPH無水乙醇溶液，充分混勻后避光反應(yīng)30 min，于波長517 nm處測(cè)定吸光度值為Ai，VC作陽性對(duì)照；對(duì)照組以無水乙醇代替DPPH，測(cè)定吸光度值A(chǔ)j；空白組以蒸餾水代替總黃酮溶液，測(cè)定吸光度值為A0[21]。

（2）羥基自由基清除能力測(cè)定

取0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL的石斛花總黃酮溶液各3mL，加入1.0 mL 6 mmol/L硫酸亞鐵、1.0 mL 10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，加入1 mL 6 mmol/mL過氧化氫，置于37℃反應(yīng)10 min，于波長510 nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)i。以VC作為陽性對(duì)照，蒸餾水代替水楊酸測(cè)吸光度值A(chǔ)j，空白對(duì)照以2.0 mL蒸餾水代替石斛花總黃酮溶液測(cè)定吸光度值A(chǔ)0[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

根據(jù)圖1，求得回歸方程A=8.7361C-0.0024，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 4，表明在該濃度范圍內(nèi)蘆丁濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 鐵皮石斛花總黃酮提取單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 料液比對(duì)鐵皮石斛花總黃酮提取率的影響

圖2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可知，料液比在1∶20～1∶35范圍內(nèi)，隨著體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液使用量的增加，細(xì)胞壁內(nèi)外濃度差增加，細(xì)胞內(nèi)有效成分易滲出，石斛花總黃酮提取率增加；此后，繼續(xù)增加溶劑用量，由于空化泡吸收的超聲波能量減少，細(xì)胞壁破裂不完全不利于提取溶出[20]，總黃酮提取率呈下降趨勢(shì)。因此，鐵皮石斛花總黃酮提取時(shí)的最佳料液比為1∶35（g∶mL）。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)鐵皮石斛花總黃酮提取率的影響

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～80%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率呈增加趨勢(shì)；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80%時(shí)，由于醇溶性雜質(zhì)溶出量增加，總黃酮提取率降低。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇80%較為適宜。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

圖4 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，超聲時(shí)間在10～40 min范圍內(nèi)，鐵皮石斛花總黃酮提取率隨超聲時(shí)間的延長而增加；當(dāng)超聲時(shí)間超過40 min時(shí)，由于長時(shí)間的熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)破壞了部分黃酮結(jié)構(gòu)，黃酮提取率下降[23]。因此，鐵皮石斛花總黃酮提取的最佳超聲時(shí)間為40 min。

2.2.4 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

圖5 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，超聲溫度在30～40℃范圍內(nèi)，隨著超聲溫度的升高，乙醇容易向石斛花粉內(nèi)部滲透，利于有效成分浸出，鐵皮石斛花總黃酮提取率逐漸增加；此后，繼續(xù)升高溫度，部分黃酮在高溫作用下結(jié)構(gòu)受損[24]，總黃酮提取率下降。因此，選擇溫度40℃為最佳超聲溫度。

2.3 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

為確定最佳提取條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間對(duì)鐵皮石斛花總黃酮提取的影響，以石斛花總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

通過表3中提取率的極差分析結(jié)果可知，影響提取率的各因素主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲溫度＞超聲時(shí)間＞料液比。從k值得出使石斛花總黃酮提取最佳的工藝條件為A2B2C2D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶35（g∶mL），超聲溫度40℃，超聲時(shí)間50min，在此條件下石斛花總黃酮提取率最高，為2.31%。由表3方差分析結(jié)果可知，因素A、C對(duì)石斛花總黃酮提取率有極顯著影響（P＜0.01），因素B、D對(duì)石斛花總黃酮提取率有顯著影響（P＜0.05），對(duì)總黃酮提取率影響的主次順序?yàn)锳＞C＞D＞B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲溫度＞超聲時(shí)間＞料液比，與直觀分析結(jié)果一致。

2.4 鐵皮石斛花總黃酮體外抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

圖6 石斛花總黃酮對(duì)DPPH·清除率曲線Fig.6 Scavenging curves of total flavonoids from Dendrobium officinaleflowers on DPPH·

由圖6可知，石斛花總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著總黃酮濃度的增加，清除率增加；質(zhì)量濃度在0～2 mg/mL范圍內(nèi)，石斛花黃酮的DPPH自由基的清除率顯著低于VC，VC質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)DPPH自由基的清除率就達(dá)到90.35%，而此時(shí)石斛花黃酮的DPPH自由基的清除率僅為39.37%，繼續(xù)增加VC含量其DPPH自由基的清除率無顯著變化，而石斛花黃酮的DPPH自由基的清除率呈濃度依賴性變化，質(zhì)量濃度達(dá)2 mg/mL時(shí)，石斛花黃酮的清除率達(dá)到82.98%。質(zhì)量濃度在2～10 mg/mL范圍內(nèi)，VC的DPPH自由基的清除率依舊無顯著變化，石斛花黃酮的DPPH自由基的清除率緩慢趨近VC的清除率，當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)石斛花黃酮的DPPH自由基的清除率達(dá)89.77%。

2.4.2 清除羥自由基能力的測(cè)定

圖7 石斛花總黃酮對(duì)·OH清除率曲線Fig.7 Scavenging curves of total flavonoids from Dendrobium officinaleflowers on·OH

由圖7可知，石斛花總黃酮對(duì)羥自由基的清除率具有濃度依賴性，清除率隨濃度的增加而增加，質(zhì)量濃度在0～10 mg/mL范圍內(nèi)，石斛花黃酮的羥自由基清除率顯著低于VC，VC質(zhì)量濃度為0.5mg/mL時(shí)羥自由基清除率為90.26%，而此時(shí)石斛花黃酮的羥自由基清除率僅為11.29%，進(jìn)一步的提高質(zhì)量濃度，VC的羥自由基清除率無顯著變化，石斛花黃酮的羥自由基清除率呈濃度依賴性變化，當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)石斛花黃酮的羥自由基清除率達(dá)80.01%。

3 結(jié)論

本研究探討了鐵皮石斛花總黃酮的提取工藝，結(jié)果表明，各因素影響鐵皮石斛花總黃酮提取率的主次順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲溫度＞超聲時(shí)間＞料液比。通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定超聲波乙醇法提取鐵皮石斛花總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶35（g∶mL），超聲溫度40℃，超聲時(shí)間50 min，在此條件下鐵皮石斛花多糖提取率為2.31%。對(duì)超聲波乙醇法提取的鐵皮石斛花總黃酮進(jìn)行DPPH自由基清除率和羥自由基清除率測(cè)定，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度在0～10 mg/mL范圍內(nèi)鐵皮石斛花總黃酮的自由基清除率具有濃度依賴性，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)10 mg/mL時(shí)，其清除率分別為89.77%和80.01%，因此石斛花黃酮有較好的抗氧化活性。這為鐵皮石斛花的深入研究及開發(fā)利用提供了一定的理論參考。